来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
随着全球航空业碳减排压力日益加剧，以合成生物学手段生产可持续航空燃料（SAF）前体成为研究热点。近日，一项发表于《Metabolic Engineering》的研究中，Yunus 等人以工业底盘微生物恶臭假单胞菌为对象，开发了一套预测型CRISPR干扰（CRISPRi）基因下调系统。该工作不仅实现了 SAF 前体——红没药烯产量的大幅提升，更通过构建“设计-构建-测试-学习”闭环，建立了一种可推广的代谢工程理性改造范式，为微生物细胞工厂的精准调控提供了全新工具与思路。
研究背景
航空业每年排放的二氧化碳约占全球人为排放总量的 2–3%，并且其增长速度远超其他交通领域。可持续航空燃料因与现有航空发动机和加油基础设施高度兼容，被视为中短期内实现航空脱碳最现实的技术路径。其中，倍半萜类化合物红没药烯（bisabolene）经化学加氢后可获得高能量密度、低温性能优异的支链烷烃，是极具潜力的“即用型”SAF 前体。然而，与传统化石航煤相比，微生物发酵法生产红没药烯的成本仍偏高，核心瓶颈在于底盘细胞的碳通量流失到诸多非必要的竞争途径中，极大地限制了目标产物的合成效率。
过去十年中，研究者尝试通过逐个敲除或过表达关键基因来重新分配代谢流，但这些传统操作手段往往费时费力，且无法应对复杂代谢网络中因基因扰动带来的级联效应。更为根本的是，许多编码竞争途径酶的基因是生长必需的，完全敲除会导致菌体适应度显著下降，反而拖累产物积累。因此，亟需一种能够精确、可逆地微调多个基因表达强度的工具，以在维持细胞正常生理负担的同时，最大化碳流转向目标途径。
CRISPR 干扰技术通过丧失切割活性的 dCas9 蛋白与靶向小向导 RNA（sgRNA）结合，实现对任意基因的转录抑制，不改变基因组序列，且下调幅度可通过 sgRNA 序列设计进行调控。然而，如何从底盘基因组中成百上千个候选基因中快速锁定最优的干扰靶点，并对多个靶点的下调强度进行组合优化，仍是一个巨大挑战。Yunus 等人的此项研究正是针对这一空白，提出了融合代谢模型与机器学习预测的 CRISPRi 工作流，并成功应用于红没药烯高产菌株的构建。
研究方法
该团队的研究路线可概括为四个连续递进的阶段：靶点预测与文库构建、高通量筛选与组学解析、模型训练与理性设计、以及最终的发酵验证与工艺放大。
首先，研究人员以恶臭假单胞菌 KT2440 的基因组尺度代谢模型（GEM）为基础，结合途径通量平衡分析与通量可变性扫描，系统评估了所有能够将碳代谢流“拉回”前体（法尼基焦磷酸，FPP）合成途径的潜在基因干扰靶点。他们将关注点集中在编码糖酵解旁路、三羧酸循环溢出反应、脂肪酸合成起始以及非必需辅因子消耗等方向的 84 个基因，并针对每个基因设计了 3 条不同靶向区域的 sgRNA，构建了一个包含 252 种 CRISPRi 变体的阵列式文库。为方便后续标准化比较，所有 sgRNA 均被克隆至一个整合型载体中，并转入已携带红没药烯合成酶基因和甲羟戊酸途径强化模块的基础菌株内。
接着，团队利用 96 深孔板微型发酵系统，结合气相色谱-质谱联用（GC–MS）测定每一株变体的红没药烯产量及生物量，从而获得每种基因下调与产物合成、生长速率之间的定量关系。针对表现最优的十余种 sgRNA 菌株，研究者进一步开展了转录组学分析，以揭示不同基因下调所引发的全转录谱变化。这些数据不但验证了关键竞争节点的成功弱化，还意外地发现红没药烯产量与细胞膜压力响应、氧化还原平衡相关基因的共变关系，提示次级代谢调控网络远比预期复杂。
在获得上述高通量特征数据之后，团队将每种 sgRNA 的时序性表征值（靶基因转录抑制率、生长速率、糖耗速率、FPP 池大小等）作为输入特征，训练了一个基于梯度提升决策树的机器学习模型。该模型能够以约 0.91 的相关系数预测不同组合干扰下的红没药烯产量。随后，他们在模型空间中开展虚拟筛选，评估了超过 10 000 种逻辑上可行的二基因和三基因同时下调组合，并从中选出 6 组预期产量最高的设计进入实际构建。
最终阶段，这些最佳组合被重建到同一宿主中，并在摇瓶和 2 L 发酵罐条件下进行分批补料发酵验证。发酵过程采取葡萄糖限制流加策略，并实时监测溶氧和尾气质谱数据以评估代谢负担。整体实验设计充分体现了从“假设驱动”走向“数据驱动”的代谢工程新趋势。
研究结果
研究结果揭示了单一基因下调与组合调控对红没药烯积累的显著且差异化影响。
在单靶点筛选层面，84 个候选基因中有 31 个在适度下调后显示产物浓度提高 20% 以上，表明这类基因原本的转录水平确实构成了碳流“泄漏点”。其中，效果最为突出的三个靶点是：编码 6-磷酸葡萄糖酸内酯酶的 pgl，其下调有效抑制了戊糖磷酸途径的氧化分支，保留更多葡萄糖-6-磷酸回流至糖酵解；编码脂酰-ACP 硫酯酶的 tesB 及其同源物，其下调减少了脂肪酸合成的起始碳流消耗；以及编码非必需铁硫簇支架蛋白的 iscR，下调后缓解了铁硫簇合成对半胱氨酸和还原力的分流。单靶点最优菌株在摇瓶培养 24 小时后红没药烯滴度达到 1.8 g/L，较出发菌株提高 3.2 倍，而生物量仅下降约 15%，证实了 CRISPRi 精细调低（而非敲除）的优势——细胞在保留足够代谢灵活性的同时，将多余碳通量“逼”向产物合成。
多靶点组合的结果更为惊艳。在机器学习模型排名最高的双靶点组合中，pgl 与 tesB 的同步抑制表现出突出的协同效应，红没药烯滴度跃升至 4.3 g/L，是单靶点最优菌株的 2.4 倍。进一步引入第三个靶点——编码 PHB 聚合酶的 phaC（聚羟基脂肪酸酯合成途径的首个基因）后，三靶点组合菌株的产物滴度在摇瓶中达到 6.1 g/L。更令人关注的是，三基因低强度下调并没有造成严重的生长停滞，最大比生长速率仅从 0.45 h⁻¹ 降低至 0.35 h⁻¹，这为后续高密度发酵奠定了坚实基础。
在 2 L 发酵罐中的补料分批发酵实验中，三靶点组合菌株展现出良好的工业应用潜力：通过控制细胞生长和产物合成两个阶段的最佳溶氧与补糖速率，发酵 60 小时后红没药烯滴度达到 23.5 g/L，单位细胞产率达到 0.15 g/(g DCW·h)，糖苷转化率达到 0.12 g/g 葡萄糖。这一性能在目前公开报道的恶臭假单胞菌合成萜类化合物中位居前列。转录组与代谢中间体分析进一步证实，pgl 和 tesB 下调分别使 FPP 前体池扩大了 4.8 倍和 2.2 倍，且胞内辅因子 NADPH/NADP⁺比率提升了约 1.6 倍，为红没药烯合成酶提供了充足驱动力和还原能。
值得注意的是，机器学习模型在预测三靶点组合时，其准确度仅略低于双靶点（R² = 0.86 vs 0.91），这说明基因组扰动的累积效应仍具有一定的非线性，但整体上模型已具备很强的工程指导价值。该闭环优化全过程仅需约 4—6 周，极大加速了“设计-构建-测试”周期。
讨论与展望
这项研究的突破性不仅在于将红没药烯的产量推向了一个新高度，更在于提供了一种路径清晰、可复制的预测型代谢工程策略。传统的“敲除-筛选”方式好比闭着眼睛碰运气，而 Yunus 等人的工作则像加装了导航系统，通过代谢模型、转录组数据和机器学习三方协同，一步一步算出了最可能成功的改造靶点及其下调力度。
从机制层面看，pgl 和 tesB 等靶点的有效性反映了恶臭假单胞菌中碳流分配存在“粘性节点”——这些酶反应速率虽然不高，却决定了碳骨架的分流方向。CRISPRi 的梯度可调特性恰好提供了一种精细的“流量阀门”，避免了敲除带来的全有或全无效应。同时，转组学数据暗示细胞膜完整性和还原力稳态可能是限制萜类高效合成的新瓶颈，未来可将膜工程或辅因子再生模块耦合进已有优化流程，实现多点协调优化。
方法论上的贡献同样值得关注。该研究所构建的“代谢模型初筛 → 阵列化 CRISPRi → 组学特征提取 → 机器学习预测 → 发酵验证”闭环，有望被推广至其他工业微生物（如谷氨酸棒杆菌、酵母等）和不同产物（如生物碱、聚酮等）。事实上，影响该闭环效率的关键因素之一是高通量表型数据的获取速度与数据维度，随着自动化发酵平台和合成生物学设施的普及，此类策略在设计更大规模组合扰动时将更具威力。
当然，走向产业化仍需克服诸多挑战。目前 23.5 g/L 的产量虽然已经迈过经济可行性初步门槛，但下游产物提取与宿主遗传稳定性仍需优化。此外，连续长时间发酵中 CRISPRi 元件的表达稳定性、sgRNA 突变累积等都需要通过宿主优化或负反馈控制网络来解决。未来如果能将生物传感器与该调控系统结合，实现响应代谢中间物的自动下调，将使“细胞工厂”从概念走向现实。总之，这项研究为可持续航空燃料的生物制造提供了一个高性能底盘和一套高效算法，是合成生物学向实际工业应用迈进的重要一步。
参考来源
Yunus I S, Carruthers D N, Chen Y, et al. Predictive CRISPR-mediated gene downregulation for enhanced production of sustainable aviation fuel precursor in Pseudomonas putida[J]. Metabolic Engineering, 2025. DOI: 10.1016/j.ymben.2025.11.007.
DOI: 10.1016/j.ymben.2025.11.007