来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
天然产物是药物研发的核心源泉，但其复杂结构常使传统化学合成与天然提取步履维艰。利用合成生物学策略，在微生物底盘细胞中异源重构天然产物的生物合成途径，已成为突破瓶颈的关键手段。近日，日本学者在《Communications Biology》发表研究，通过系统级的基因组编辑工程，对丝状真菌的多条内源代谢通路进行重塑，成功构建了一株兼具高产量与广泛适应性的通用型异源表达宿主，为复杂天然产物的绿色制造提供了全新的细胞工厂解决方案。
研究背景
微生物天然产物及其衍生物贡献了临床上超过60%的抗感染和抗癌药物。然而，许多高价值天然产物的原生生产者生长缓慢、遗传操作困难或产量极低，严重制约了其深入研究和产业化开发。异源生物合成——即将目标产物的完整基因簇导入易培养、遗传背景清晰的模式底盘细胞中——被视为解锁这些“暗物质”金矿的钥匙。大肠杆菌、酿酒酵母等经典底盘虽已取得瞩目成就，但对于许多来源于真菌的复杂聚酮、非核糖体肽及萜类化合物而言，由于内含子剪接、密码子偏好性、前体供给及细胞区室化等真核特性的差异，原核或低等真核宿主往往难以实现功能性表达和高效产出。
丝状真菌，尤其是曲霉属（*Aspergillus*）物种，因其强大的蛋白质分泌能力和丰富的次生代谢前体（如乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、氨基酸等）供给，被认为是重构真菌源天然产物的理想底盘。然而，天然的丝状真菌宿主也存在明显短板：内源次级代谢网络庞杂，会分流关键前体并与异源途径形成竞争；菌丝体形态发酵黏度高，传质受限；有限的遗传操作工具难以实现多位点、多层次的系统代谢工程。该领域亟需一种通用策略：通过精准、多重基因组编辑，系统性地清除代谢“噪音”、拆除竞争途径、强化前体供应，从而将一株普通的丝状真菌改造为专一性高、可塑性强的高产平台。本研究正是基于这一思路，以基因组编辑为核心武器，对丝状真菌宿主进行了从“减法”到“加法”再到“全局优化”的系统升级。
研究方法
研究团队选取遗传背景较清晰、天然次生代谢产物相对简单的丝状真菌作为出发菌株，设计了一套“代谢通路手术式改造”技术路线。
**第一步，底盘基因组的“清零”与精简。** 利用CRISPR/Cas9系统对基因组中多个内源天然产物生物合成基因簇进行靶向删除。这些基因簇不仅消耗大量碳源、氮源和能量，其代谢中间体还可能对异源途径产生毒性或调控干扰。通过多轮迭代式基因组编辑，作者剔除了包括聚酮合酶、非核糖体肽合成酶以及萜类环化酶编码基因簇在内的多个大型次级代谢岛，获得了一株背景干净、代谢流更加集中可控的“初级代谢底盘”。
**第二步，前体供给路径的“高速公路”构建。** 高效合成聚酮类和萜类天然产物的核心在于充足的前体供应——特别是乙酰辅酶A和甲羟戊酸。研究团队在清理次级代谢旁路的基础上，对初级代谢的关键节点进行精准上调。通过启动子工程，将限速酶基因（如乙酰辅酶A羧化酶、甲羟戊酸途径的HMGR）的天然启动子替换为强组成型或诱导型启动子，并以多位点整合的方式增加拷贝数，从而显著拉高胞内前体库。同时，竞争支路如脂肪酸β-氧化途径的关键酶基因被选择性弱化或敲除，进一步将代谢碳流“推”向目标前体池。
**第三步，异源途径的“模块化即插即用”适配。** 为验证宿主的多功能通用性，作者选择了结构迥异、分别代表聚酮、杂合聚酮-非核糖体肽、萜类等类型的多种天然产物作为报告分子。采用Gateway克隆或酵母同源重组技术，将完整的生物合成基因簇连同途径特异性转录调控因子，装配到经优化的人工染色体或基因组特定安全位点表达载体上。多基因的协调表达通过双向启动子、2A肽“自剪切”序列等合成生物学元件得以精细调控。
**第四步，发酵生理的匹配与优化。** 丝状真菌的液体发酵常面临菌球过大致使内部缺氧和营养梯度限制的问题。研究者结合形态学工程，通过调节接种孢子浓度、培养基渗透压及添加微量无机粒子，控制菌丝体呈松散小球或弥散短菌丝形态，大幅改善氧传质和营养吸收，使高密度发酵成为可能。
整个构建过程呈现“设计-构建-测试-学习”的合成生物学闭环。每一步改造均通过全基因组测序、转录组分析和靶向代谢组学检测进行多维验证，确保基因型精确无误、代谢流量按预定方向重塑。
研究结果
经过系统改造的丝状真菌底盘菌株展现出卓越的性能提升和广泛的异源适配性。
在基础代谢性能方面，经过初级代谢和前体途径优化的底盘菌株，胞内乙酰辅酶A和甲羟戊酸浓度较野生型菌株提高了数倍至十多倍。转录组数据揭示，在删除大型次级代谢基因簇后，菌体的整体转录资源重新分配，初级代谢和能量代谢相关基因表达显著增强，菌体比生长速率未受影响，提示清理次级代谢“负担”释放了可观的细胞资源。
在异源天然产物合成能力测试中，该平台表现惊艳。对于聚酮类化合物，以著名的降胆固醇药物洛伐他汀前体莫纳可林J为测试对象，将*Monascus*属来源的洛伐他汀九酮合酶基因簇导入工程化底盘后，其摇瓶产量达到野生型异源表达菌株的数十倍，创下丝状真菌中该产品异源合成的最高报告水平。更关键的是，当换用来源不同、GC含量和内含子结构差异巨大的另一聚酮合酶基因簇（负责产嗜氮酮类色素）时，底盘无需进行额外的密码子优化或剪接因子过表达，即可实现高效的转录后加工与功能性翻译，终产物产量同样实现数量级飞跃。
对于杂合聚酮-氨基酸类化合物，作者测试了免疫抑制剂霉酚酸途径。导入重排后的生物合成基因簇，工程菌株合成了高纯度的目标中间体，产量远超大肠杆菌和酵母系统，且几乎未检测到内源性次级代谢干扰物，下游纯化极为便捷。
在萜类化合物方面，选择代表性半萜、二萜及三萜进行了系统验证。甲羟戊酸途径的全局增强使得各类萜烯合酶获得强力前体支撑。特别地，利用该平台成功高效生产了一种结构复杂、具有潜在抗癌活性的二萜类化合物，异源产量达到克升级潜力，为过去的毫克级瓶颈带来了大幅跨越。
形态学工程与发酵调控的结合放大了代谢优势。在5 L生物反应器中，控制菌丝呈弥散形态的工程菌株，其目标产物产量相较于自然球状形态再提高3-5倍，发酵周期缩短30%，展现了极佳的工业化放大潜力。
数据还表明，基因组精简后的宿主在遗传稳定性和环境适应性方面表现优异。连续传代超过60代，异源合成能力未见下降，重组基因簇未发生重排或丢失。多维度分析证实，这种多代谢途径协同工程策略，成功地让一个普通丝状真菌蜕变为高产、稳定、通用的“超级底盘”。
讨论与展望
该研究的意义不仅在于获得了几种天然产物在丝状真菌中的高产记录，更在于其示范了一种可在任何可遗传操作真菌中复制的系统工程策略。通过“背景净化—前体富集—模块化引入—形态适配”的多层次改造框架，厘清了内源代谢网络与异源途径之间的复杂互作逻辑，为解决合成生物学中“底盘与途径错配”这一核心难题提供了新思路。
展望未来，该通用底盘可望整合更先进的合成生物学工具，如正交生物传感器、动态代谢调控回路以及基于计算的酶设计，进一步实现从“静态高产”到“自适应生产”的跨越。同时，将该平台的改造逻辑迁移至嗜热真菌或其他安全可食用丝状真菌，将极大地拓展其在食品、材料以及高值化学品生产中的应用边界。对于合成生物学领域而言，这项工作有力地证明：当基因组编辑技术从单基因操作迈入多代谢网络全局重塑的新阶段，微生物细胞工厂的设计将愈发接近于工程学上的“即插即用”与“预测性设计”，天然产物的规模化异源智造浪潮正加速到来。
参考来源
Naoya Saito, Takuya Katayama, Atsushi Minami, Hideaki Oikawa, Jun-ichi Maruyama. Versatile filamentous fungal host highly-producing heterologous natural products developed by genome editing-mediated engineering of multiple metabolic pathways. *Communications Biology*, 2024. DOI: 10.1038/s42003-024-06958-0.
DOI: 10.1038/s42003-024-06958-0