来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
3-羟基丙酸（3-HP）是一种极具潜力的平台化合物，可用于合成高性能聚合物、丙烯酸、1,3-丙二醇等高值化学品。然而，利用微生物从可再生原料直接合成3-HP，始终面临前体供应不足、辅因子失衡及代谢副产物积累等瓶颈。近期，Wang等人在bioRxiv预印本上发表了一项突破性研究，通过系统代谢工程对大肠杆菌进行多维度改造，成功构建了一株高效生产3-HP的工程菌，在补料分批发酵中的产量突破40 g/L，为3-HP的绿色生物制造提供了全新范式。
研究背景
3-羟基丙酸位列美国能源部遴选的12种最具价值的生物基平台化合物之一，其分子内同时含有羟基和羧基，可通过化学或生物催化转化为多种大宗化学品。传统化学合成法依赖丙烯酸水合或氰乙烷路线，存在高温高压、副反应多、依赖石化原料等问题。相比之下，以工程化微生物为细胞工厂，利用葡萄糖、甘油等廉价碳源合成3-HP，因条件温和、可再生、环境友好等优势，成为近年来的研究热点。
自然界中已知的3-HP合成途径主要有两类：一是以甘油为底物的甘油脱水酶-醛脱氢酶途径；二是以糖类为核心底物的丙二酸单酰辅酶A（malonyl-CoA）途径和β-丙氨酸途径。其中，丙二酸单酰辅酶A途径因其底物葡萄糖供应充足、理论得率高、且与中心碳代谢直接耦合，被认为具有最佳的大规模应用前景。该途径的关键在于乙酰辅酶A经乙酰辅酶A羧化酶（ACC）催化生成丙二酸单酰辅酶A，再由丙二酸单酰辅酶A还原酶（MCR）利用NADPH将其直接还原为3-HP。
然而，野生型大肠杆菌并不能天然合成3-HP，且胞内丙二酸单酰辅酶A主要用于脂肪酸合成，池浓度极低。即便异源表达MCR，也需同时强化前体供应、优化氧化还原平衡，并克服代谢溢流导致的副产物积累。如何在多个代谢模块之间实现精细的“推-拉-调”协同，一直是该途径工程化改造的核心难题。Wang等人的工作，正是围绕上述瓶颈展开了一次综合性攻关。
研究方法
该研究以大肠杆菌BW25113作为出发菌株，围绕丙二酸单酰辅酶A途径进行了模块化代谢工程改造，总体技术路线分为前体强化、途径优化、中心碳流重定向以及辅因子平衡四个层面。
**1. 目标途径的搭建与优化。**
研究者首先从橙色绿屈挠菌（*Chloroflexus aurantiacus*）中克隆了编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因*CaMCR*，并将其置于强组成型启动子P*trc*之下，整合至高拷贝质粒pTrc99a中，使大肠杆菌获得从胞内源性丙二酸单酰辅酶A合成3-HP的基础能力。同时，为提升途径效率，对MCR的核糖体结合位点（RBS）序列进行文库筛选，获得翻译起始速率最优的变体，实现了酶表达水平的精细调控。
**2. 前体丙二酸单酰辅酶A代谢池的强化。**
前体匮乏是限制3-HP合成的首要因素。研究团队在染色体上过表达大肠杆菌内源的乙酰辅酶A羧化酶基因*accBC*和*accD1*，同时导入一株经过定向进化解除了长链酰基-ACP反馈抑制的*acc*操纵子。更进一步，通过敲除脂肪酸合成途径中的*fabF*基因，有效阻断了丙二酸单酰辅酶A向脂肪酸骨架延伸的流向，迫使其池浓度大幅度提升，形成强大的前体“推力”。
**3. 竞争性副产物途径的系统阻断。**
大肠杆菌在快速糖酵解时极易发生溢流代谢，将过量丙酮酸转化为乳酸、乙酸、乙醇等胞外副产物，损耗碳流并造成酸性胁迫。研究者利用CRISPR-Cas9基因编辑系统，依次对*ldhA*（乳酸脱氢酶）、*adhE*（乙醇脱氢酶）、*poxB*（丙酮酸氧化酶）和*pta-ackA*（乙酸激酶-磷酸转乙酰酶）进行敲除，构建了几乎无溢流副产物的底盘菌株。所有敲除位点均通过测序验证，并从转录组水平确认相关基因的完全沉默。
**4. 氧化还原辅因子平衡的重新布线。**
从丙二酸单酰辅酶A到3-HP的还原步骤需要消耗NADPH，而糖酵解过程中NADH的积累远高于NADPH。为维持合成反应的还原力供给，研究者在基因组上整合了来源于枯草芽孢杆菌的转氢酶基因*pntAB*，高效催化NAD⁺和NADPH的相互转化，将糖酵解产生的NADH迅速转化为NADPH。同时，通过弱化TCA循环中的*icd*（异柠檬酸脱氢酶）表达，减少α-酮戊二酸分流，确保NADPH主要流向产物合成途径。
**5. 发酵工艺的系统优化。**
在摇瓶规模完成菌株构建和初步评价后，研究团队在5 L发酵罐中对最优工程菌株进行了补料分批发酵测试。通过DO-stat反馈控制策略，使溶氧始终维持在30%以上，同时依据pH调控补酸速率，有效避免了3-HP积累导致的胞质酸化。碳源供给采用指数补加葡萄糖模式，维持比生长速率在0.15 h⁻¹的临界值以下，从而彻底消除了克勒勃效应，保障了产物合成期的碳流定向效率。
研究结果
通过上述分步骤的代谢工程改造，3-HP的合成能力呈现出清晰的阶梯式上升趋势。
摇瓶发酵结果显示，仅引入*CaMCR*基因的初始菌株BW01仅能积累约0.52 g/L的3-HP，表明前体供应严重不足。过表达*acc*基因并对RBS进行优化后，菌株BW02的3-HP产量跃升至5.4 g/L，提升了逾10倍。随后对*ldhA*和*adhE*的单一敲除，使BW03菌株产量达到8.9 g/L，同时乳酸和乙醇积累量分别下降93%和88%。进一步结合*pta-ackA*和*poxB*的阻断，构建得到的菌株BW04在摇瓶中生产了13.6 g/L的3-HP，比初始菌株提高26倍，副产物中仅可检测到痕量的琥珀酸，碳流纯度极高。
氧化还原平衡改造的效果尤为显著。整合*pntAB*转氢酶后，BW05菌株胞内NADPH/NADP⁺比值由改造前的0.85显著上升至2.43，3-HP摇瓶产量进一步提升至18.2 g/L，同时葡萄糖转化率达到0.31 g/g，接近理论最高得率（0.56
DOI: 10.1101/2025.08.26.672340