来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**
面对化石资源枯竭与气候变化的双重挑战，利用产乙酸菌将一氧化碳（CO）等合成气组分转化为燃料和化学品已成为绿色生物制造的重要路线。然而，传统代谢工程手段难以在发酵过程中动态平衡细胞生长与产物合成，导致产率受限。近日，研究人员成功开发了一套CO气体感应型转录ON/OFF控制模块，首次在产乙酸菌中实现了基因表达的实时、可逆调控，并将其应用于代谢途径的动态重排，显著提升了目标产物合成效率。该工作为气体发酵的自动化调控开辟了新范式。
1. 研究背景
产乙酸菌是一类能够通过伍德-永达尔（Wood-Ljungdahl）途径固定CO、CO₂和H₂的厌氧微生物，可自然合成乙酸、乙醇、丁酸等化学品，被视为合成气发酵的理想底盘。然而，其代谢网络受复杂氧化还原平衡与能量限制，当碳通量过度导向生物量积累时，目标产物得率往往偏低；若简单敲除竞争途径，又可能损害菌株鲁棒性。因此，开发环境响应型动态调控工具，使细胞在发酵前期快速生长、后期高效积累产物，成为破解该难题的关键思路。
近年来，在模式微生物中已涌现多种诱导型表达系统，但产乙酸菌中可用的严格调控元件十分匮乏。尤其基于物理或化学诱导剂的方法（如IPTG、脱水四环素）存在成本高、不可逆或干扰代谢等缺点。相比之下，气体诱导物CO既是合成气的主要成分，又能作为电子供体直接参与代谢，若能将其转化为基因表达信号，将极大简化工艺且更契合实际发酵场景。源于深红红螺菌（*Rhodospirillum rubrum*）的CO感应转录激活因子CooA及其同源启动子PcooF，可专一性结合CO后触发下游转录，是构建CO气体开关的理想候选元件。然而，该模块在产乙酸菌中的跨物种适配性、动态性能及代谢工程实效尚未被系统探索。
2. 研究方法
研究团队以产乙酸模式菌株*Acetobacterium woodii*和*Clostridium ljungdahlii*为底盘，采用“设计—构建—测试—学习”循环，系统构建并表征了CO感应ON/OFF模块。技术路线分为四个阶段：
**开关模块构建与优化：** 从*R. rubrum*基因组扩增*cooA*基因及PcooF启动子，通过重亚硫酸盐测序无细胞系统初步验证CO依赖的激活特性。随后将其克隆入穿梭载体，以*mCherry*红色荧光蛋白或*cat*（氯霉素抗性）作为报告基因，构建一系列变体库。通过对CooA蛋白的CO结合域进行饱和突变以及调整启动子-35/-10区间隔序列，筛选出开关比（ON/OFF ratio）高、背景泄漏低的候选模块。
**动态性能表征：** 将优化后的模块转入*C. ljungdahlii*，在密闭厌氧培养体系中精确控制气相CO分压（0%–20%），定时取样测定荧光强度与转录本丰度。同步记录生长曲线和底物消耗，归一化处理得到启动子强度与比生长速率的关系。通过脉冲式交替通入CO和N₂，评估开关的响应速度、可逆性和循环稳定性。
**代谢途径动态调控设计：** 选择乙酸激酶（*ack*）和磷酸转乙酰酶（*pta*）这两个乙酸合成关键基因为调控靶点。利用CRISPRi系统，将CO感应模块驱动dCas9表达；同时构建基于PcooF的反义RNA干扰系统，以对比两种沉默策略的效能。将上述回路整合至*C. ljungdahlii*染色体，获得可编程调控的工程菌株。
**发酵验证与多组学分析：** 在5 L气升式发酵罐中开展补料分批发酵，实时调控CO分压，监测乙酸、乙醇和生物量动态。采用定量蛋白质组学和代谢通量分析，解析开关激活前后中心碳代谢网络的重新分配，计算碳回收率与电子平衡。
3. 研究结果
经过高通量筛选，最终获得了性能优异的变体CooA-M3/PcooF-opt。该模块在无CO条件下报告基因表达量接近背景水平；当气相CO分压升至5%时，荧光强度迅速上升，10% CO下达最大激活水平，开关比超过180倍。响应时间测试显示，从气体切换至基因表达显著变化仅需12分钟，回至关闭状态的半衰期约25分钟，且连续10次开-关循环后性能无明显衰减，展现了快速、可逆和稳定的动态特征。
将CO开关应用于CRISPRi介导的*ack*抑制后，工程菌株的代谢流发生了显著重分布。在发酵前期（0–24小时），维持无CO环境，细胞正常生长并积累乙酸；进入产物合成期后通入10% CO，*ack*转录水平被迅速沉默至未诱导时的8%以下。乙酸合成旁路关闭后，碳通量主要转向乙醇生成，最终乙醇滴度达到42.5 g/L，较野生型提高2.8倍，乙酸残留量降低至4.7 g/L。乙醇对乙酸的选择性由对照组的1.3跃升至9.0。还原力平衡分析表明，胞内NADH/NAD⁺比率在开关响应后提升了1.7倍，推动醇脱氢酶催化的还原步骤高效进行。
利用反义RNA干扰*pta*的实验也得到了类似趋势，但沉默效率略低（降至15%），对应乙醇产量为35.8 g/L，提示CRISPRi策略在产乙酸菌中具有更优的抑制动力学。另一项重要发现是，CO本身作为共底物，在开关激活的同时也向细胞提供了额外电子，进一步增强了产物的还原度。该偶联效应使产物的胞得率超越了仅通过代谢路径重排的理论值。
多组学数据进一步揭示，CO开关介导的代谢重编程不仅抑制了乙酸合成，还上调了铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶系列基因的表达，增强了糖酵解逆向通量，从而为乙酰-CoA还原为乙醇持续供应还原力。对照组组成型敲除*ack*的菌株虽然乙醇产率提升，但发酵前期生长速率下降了35%，导致整体生产强度受损，充分体现了动态调控相对于静态改造的优势。
4. 讨论与展望
该研究首次在产乙酸菌中成功实现了基于CO气体的转录ON/OFF控制，构建的开关模块展现出高灵敏度、快速响应和优异可逆性，为气体发酵过程提供了与底物天然耦合的动态调控手段。通过协调细胞生长与产物合成阶段，乙醇产量大幅提升，验证了动态代谢工程策略在克服生物生产权衡方面的普适价值。值得关注的是，CRISPRi与气体开关的联用能够在不改变基因组序列的情况下精细调控基因表达剂量，有助于避免组成型修饰引起的不良代谢负荷。
未来该模块可进一步拓展应用于丁醇、己醇等更长碳链醇类的动态合成，或通过构建多输入逻辑门实现多气体组分协同调控。若能结合在线尾气质谱构建闭环反馈控制回路，则有望根据实时代谢状态自主调节CO供给与基因表达强度，推动气体发酵过程的自动化。此外，CooA蛋白的配体特异性存在改造成其他工业气体（如CO₂、H₂）感应元件的潜力，这将极大丰富产乙酸菌合成生物学工具箱，加速碳负生物制造的工业化进程。
5. 参考来源
- Jin S, Ganesh I, Bae J, Lee D, Kang S. Metabolic engineering of acetogenic bacteria using CO gas-sensing transcriptional ON/OFF modules. *Metabolic Engineering*, 2025. DOI: 10.1016/j.ymben.2025.04.012
DOI: 10.1016/j.ymben.2025.04.012