来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
自然界将酶组织在微区室中实现高效生物合成，启发科学家构建多酶级联催化体系。然而，酶不相容性、底物传递差和催化剂回收难长期制约实际应用。本研究报道了一种基于Pickering乳滴的活细胞生物催化平台——通过可调超分子化学将油基光催化剂接枝到过表达酶的E. coli表面，形成两亲性“超细菌”，自组装于水-油界面稳定乳滴，将化学催化和酶催化整合为“工厂式组装线”，反应速率较传统双相体系最高提升45倍，并实现克级安息香合成与按需双模式回收。
研究背景
生物体内的酶级联反应堪称化学制造的巅峰，能将简单前体转化为复杂高值分子，其精妙之处在于将多种酶组织于特定细胞微环境中，克服底物扩散、竞争反应和催化剂降解等难题。全细胞生物催化利用工程微生物作为自足且可自我复制的微型工厂，避免昂贵的酶纯化步骤，并原位提供辅因子，极具吸引力。然而，当涉及疏水底物或产物的多步级联时，全细胞催化面临严峻挑战：水相细胞环境与不互溶有机相之间的传质差导致反应速率低下；许多级联需要生物与化学催化剂协同（化学酶法反应），而两者往往在不相容条件下运行；有机溶剂的直接接触还会损害细胞活力。
研究方法
材料
商业化学品未经进一步纯化直接使用。大肠杆菌（BL21(DE3)）菌株购自Thermo Fisher Scientific。细胞培养和酶表达方法详见补充信息。
油基催化剂（OBC）的合成
ⅰ）油基催化剂PFA的合成
首先，将棕榈油（88.5 g，0.1 mol）倒入烧瓶中，置于100 °C油浴中脱气1小时。随后，冷却至60 °C后，通过注射加入2-(甲基氨基)乙醇（30.4 g，0.4 mol）和甲醇钠（0.6 mL，3 mmol）。反应密封过夜。12小时后，额外加入甲醇钠（0.6 mL，3 mmol），继续反应6小时。粗产物冷却至室温，用二氯甲烷（DCM）稀释。用饱和氯化钠溶液洗涤至有机相澄清。有机相用硫酸镁干燥，旋转蒸发除去溶剂，得到纯PFA。
ⅱ）油基催化剂OBC的合成
将PFA（1.5 g，4.4 mmol）、蒽醌-2-羧酸（1.0 g，4 mmol）和4-(二甲氨基)吡啶（DMAP，0.5 g，4.4 mmol）溶解于20 mL DCM中。待完全溶解后，在冰浴中逐滴加入N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC，0.9 g，4.4 mmol），反应过夜。产物过滤，旋转蒸发除去溶剂后，粗产物（有机相）经柱色谱纯化（乙酸乙酯:石油醚 = 1:3）。纯产物（OBC）为淡黄色固体。
胺化CD（ACD）的合成
第一步，将β-环糊精（β-CD，25.0 g，22.0 mmol）溶解于250 mL 0.4 M氢氧化钠溶液中，冰浴冷却至5 °C以下。随后，在剧烈搅拌下于5 min内逐渐加入对甲苯磺酰氯（17.5 g，92 mmol）。反应混合物在5 °C下持续搅拌30 min，然后过滤。所得滤液用浓盐酸中和，继续搅拌1 h。过滤收集所得沉淀，用水充分洗涤（三次），60 °C干燥过夜，得到7.1 g白色固体，即OTs-CD。
第二步，将4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺（3.4 g，15.4 mmol）和OTs-CD（4.0 g，3.1 mmol）溶解于10 mL无水N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中，随后加入碘化钾（KI，50 mg，0.3 mmol）。反应混合物在惰性无水气氛下于70 °C搅拌过夜。反应完成后，将所得黄色溶液冷却至室温，用200 mL乙醇稀释。过滤收集形成的沉淀，依次用乙醇和乙醚洗涤，并经柱色谱进一步纯化（乙腈:H₂O:氨水 = 1:1:0.2）。最后，纯化产物在50 °C下真空干燥过夜，得到2.6 g白色固体，即胺化CD（ACD）。
缀合物（cell@OBC）的制备
ⅰ）缀合物（cell@CD）的制备
freshly收集的E. coli分散于40 mL磷酸钾缓冲液（KPI buffer，pH 8.0，0.1 M）中，最终OD600为2.0。将ACD（10 mM）、EDC（18 mM）和NHS（14 mM）一起加入E. coli分散液中，4 °C反应12小时，得到粗产物。反应结束后，用KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤三次，除去过量游离ACD和未反应试剂。离心收集产物，最终缀合物（cell@CD）悬浮于KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，最终OD600为2.0，备用。
ⅱ）缀合物（cell@OBC）的制备
将收集的cell@CD分散于40 mL KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，最终OD600为2.0。随后，将溶解于4 mL DMSO中的OBC（10 mM）加入上述缓冲液，4 °C反应过夜。反应结束后，用含10% DMSO的KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤3次，除去过量游离OBC。离心收集产物（cell@OBC）。
不同E. coli的界面催化
将0.6 mL过表达不同酶的cell@OBC溶液与0.4 mL有机溶液混合，用手摇法制备乳滴。然后，在乳液中加入100 mM底物启动反应。每个时间间隔，取20 μL混合物，用180 μL乙酸乙酯萃取，随后用无水硫酸镁干燥。离心后，取150 μL上清液进行气相色谱测量。所有实验均进行三次重复。
报告摘要
研究设计的进一步信息见本文所附的Nature Portfolio报告摘要。
研究结果
活体两亲性生物催化剂的设计与合成
研究始于关键组件的模块化合成：胺化β-环糊精（ACD）主体和定制OBC客体（补充图1）。两种分子的成功合成和纯度经¹H NMR、TLC-MS和FTIR光谱严格确认（补充图2、3、4和5）。有了这些构建模块，研究团队着手改造活体E. coli BL21 (DE3)细胞表面。“超细菌”颗粒的构建是在温和、生物相容条件下执行的两步过程。第一步，通过偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将ACD主体共价接枝到细胞表面，得到cell@CD缀合物（补充图6）。第二步，引入OBC客体，通过环糊精空腔内的主客体包合自发组装到细胞表面，形成最终的cell@OBC颗粒。OBC的成功非共价附着经UV-Vis光谱证实——cell@OBC在330 nm处显示蒽醌部分的特征吸收，而天然细胞和游离OBC的对照混合物中不存在该峰（补充图7）。这一结果提供了稳定超分子连接的明确证据。关键的是，研究团队验证了蒽醌单元的光催化活性未因其缀合到OBC结构中而受阻，为后续研究提供了极好的起点（补充图8）。
为可视化表面修饰并优化其密度，研究团队使用金刚烷标记的荧光素染料（AM-FITC）对cell@CD缀合物进行荧光标记，该染料特异性结合表面接枝的环糊精空腔（图2a）。设计的核心原则是在保持细胞活力和功能的同时调节表面化学。通过改变偶联试剂（EDC/NHS）的浓度，可以精确控制细胞表面β-CD的密度，通过荧光强度的相应增加进行定量（图2b）。同时，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示cell@CD缀合物周围有明显的绿色荧光，而天然细胞或仅与染料混合的对照细胞上不存在该荧光，证实了β-CD主体的成功共价附着（图2c）。此外，修饰细胞与天然细胞之间的失重差异单调增加，揭示了表面接枝的可调性（图2d和补充图9）。随后，通过ζ-电位表征评估表面电荷，显示随着超分子负载量的增加，从天然细胞的−45 mV逐渐变为−6 mV（图2e和补充图10）。这些发现表明，细胞表面的超分子层可以被精确调控，以适应多样的功能需求。
然而，这种功能化揭示了表面修饰程度与胞内酶活性保留之间的反比关系。研究团队使用过表达苯甲醛裂解酶（BAL）的E. coli评估对胞内酶功能的影响，发现过度的表面功能化虽然增加了疏水性，但显著降低了酶的保留活性（图2f）。这种下降可能归因于致密表面层造成的传质限制或潜在的化学应激。相反，功能化不足则无法提供稳定乳滴所需的足够两亲性（图2f，插图）。通过系统优化，研究团队确定18 mM EDC和14 mM NHS的偶联条件达到最佳平衡，在维持超过97%胞内酶活性的同时赋予稳健的乳化性能。为进一步确认超分子层附着于细胞表面不会引入额外的传质屏障，研究团队裂解cell@OBC释放游离BAL酶，并将其活性与cell@OBC和天然细胞进行比较。结果显示三者之间几乎没有差异（图2g和补充图11），有力支持了研究假设，为后续研究奠定了坚实基础。
增强的细胞稳健性与生物相容性
全细胞催化的一个关键优势是细胞为酶提供的保护环境。研究团队假设表面修饰能进一步保护细胞免受过程中常见严苛条件的影响。为验证这一点，研究团队将cell@OBC缀合物置于热和化学应激条件下。当暴露于45 °C两小时时，cell@OBC保留了初始胞内BAL活性的69.6%，较未修饰的天然细胞提高2.4倍（图3a）。更引人注目的是，当面对甲苯-水界面——一种以诱导细胞裂解而臭名昭著的条件——cell@OBC缀合物在两小时后维持了52.2%的活性，而天然细胞的活性显著下降，稳定性提升达2.8倍（图3b）。研究团队还测试了其他溶剂如N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、异丙醇和二甲基亚砜（DMSO），进一步巩固了聚合物对有机溶剂的保护作用（补充图12）。此外，经2小时UV暴露后，cell@OBC的保留活性仍是天然细胞的2.1倍（图3c和补充图13）。这些发现通过活/死染色测定得到佐证，可视化显示了cell@OBC缀合物在热和有机溶剂应激下相较于天然对应物的优越活力（图3d-i）。
讨论与解读
本研究通过可调超分子表面化学策略，成功将油基光催化剂以非共价方式锚定于活体大肠杆菌表面，构建了具有两亲性的“超细菌”平台。该平台在Pickering乳滴中实现了化学酶法和多酶级联反应的高效运行，反应速率较传统双相体系提升最高达45倍，并支持单步、顺序和一步级联等多种反应模式，包括克级安息香合成。动态超分子连接还实现了按需双模式回收——活细胞缀合物可重复使用，或选择性回收合成催化剂并重新附着到新鲜细胞上。分子动力学模拟进一步评估了主体与多种客体分子的相互作用和键合过程，为超分子策略的理性设计提供了理论支撑。
编译者解读
该工作巧妙地将超分子化学与全细胞催化结合，用环糊精-客体包合替代共价键合，既保证了催化组装的稳定性，又赋予催化剂可按需拆卸回收的动态特性，这是传统固定化策略难以兼顾的。45倍速率提升和克级产物合成证明了平台的可扩展性。值得关注的是，双模式回收策略直击工业催化中催化剂成本与可持续性的痛点——光催化剂回收再装配意味着贵重的合成单元可以反复流转。不过，目前展示的酶种类仍有限，界面微环境中多酶协同的空间组织机制也尚未完全阐明，这或许是后续值得深挖的方向。从合成生物学应用视角看，该平台为“化学-酶”杂合催化提供了可推广的模块化范式。
PMID: 42342679