来源：STAR Protoc | 编译：DNA Lab Space
酵母是分子生物学实验室的常客，但给它的基因组做手术，传统方法绕不开限制性内切酶和连接酶。2025年发表在《STAR Protocols》上的一项工作，把这条老路改了——用PCR扩增直接完成引导RNA的安装，省掉酶切连接，让guide的迭代周期从几天缩短到几小时。Rostamian等人设计的这套流程，把CRISPR-Cas9编辑酿酒酵母的门槛又压低了一截。
研究背景
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是真核生物研究的模式菌株，也是合成生物学的重要底盘。CRISPR-Cas9系统在酵母中的应用早已成熟，但一个长期存在的瓶颈是单引导RNA（sgRNA）表达质粒的构建——传统方法需要限制性内切酶消化、胶回收、连接酶连接，再转化大肠杆菌。每一步都消耗时间，而且引导序列一旦需要更换，整套流程得重来。
Rostamian等人提出的方案，核心是用PCR扩增产物直接替换传统的酶切-连接步骤。他们设计了一个带有KanMX/G418筛选标记的Cas9-sgRNA共表达质粒，通过PCR在质粒上安装新的guide序列，同时实现质粒的无缝环化。这样，研究者只需合成一对引物，就能在一天内完成guide的替换，而无需依赖限制性内切酶的酶切位点。
这套流程还整合了同源定向修复（HDR）供体DNA的设计与共转化，用醋酸锂/聚乙二醇（LiAc/PEG）法将验证过的质粒和供体一起转入酵母。论文的预期结果部分显示，在G418筛选下，有HDR供体的实验组菌落远多于无供体对照组，Cas9切割的致死性恰好成为编辑成功的筛选压力。
研究方法
论文对实验流程的描述相当细致，从培养基配制到酵母转化，每一步都给出了明确参数。
培养基与试剂配制。LB液体培养基（含卡那霉素）的配方为：LB肉汤粉末25 g/L，卡那霉素储存液（50 mg/mL）终浓度50 μg/mL。配制时先将LB粉末溶于去离子水，121°C高压灭菌20–30分钟（液体循环），冷却至约55°C后加入过滤除菌的卡那霉素，轻轻混匀。不含抗生素的LB液体可在室温保存6个月，含卡那霉素的版本4°C保存1个月。LB琼脂平板（含卡那霉素）额外加入1.5%（w/v）的Bacto琼脂，121°C灭菌至少20分钟，冷却至55°C后加抗生素、倒平板，室温凝固后4°C保存。
YPD液体培养基的配方是葡萄糖2%（w/v）、蛋白胨2%（w/v）、酵母提取物1%（w/v），用去离子水定容至500 mL，121°C灭菌15–20分钟，室温保存6个月。YPD琼脂平板（含G418）则加入2%（w/v）Bacto琼脂，高压灭菌后冷却至约55°C，加入G418储存液（50 mg/mL）至终浓度500 μg/mL，混匀倒板。
guide RNA设计与质粒构建。论文的核心步骤是sgRNA和HDR供体的设计。sgRNA的靶向序列需要根据目标位点设计，HDR供体则包含编辑位点两侧的同源臂。guide插入采用PCR扩增策略——通过引物将新的guide序列引入质粒，同时利用PCR产物的末端与质粒骨架的同源序列进行重组，实现无缝环化。原文摘要未详述引物设计的具体参数（如退火温度、延伸时间等），但明确指出这种方法替代了传统的限制性内切酶/连接酶克隆。
大肠杆菌中的克隆与验证。PCR产物转化大肠杆菌后，在含卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆。卡那霉素的筛选浓度与LB培养基配方一致（50 μg/mL）。挑取克隆后需进行序列验证，确认guide序列正确插入且质粒序列无误。原文摘要未详述大肠杆菌转化的具体条件（如热激温度、时间等）。
酵母共转化。验证正确的Cas9-sgRNA质粒与HDR供体DNA一起，通过LiAc/PEG法共转化酿酒酵母。论文给出了转化后的筛选策略：转化混合物在YPD培养基中恢复培养后，涂布于含G418（500 μg/mL）的YPD平板上，30°C培养2–3天。原文摘要未详述LiAc/PEG转化的具体参数（如醋酸锂浓度、PEG分子量、热激温度与时间等），但指出共转化是同时导入质粒和供体DNA。
编辑验证。挑取6–8个酵母菌落，用跨越同源臂的引物做菌落PCR。正确编辑的克隆应产生预期大小的扩增产物。缺失和插入突变会显示相对于未编辑对照的条带位移，点突变则可能需要DNA测序确认。论文强调，测序应覆盖编辑连接处，并确认供体中引入的沉默PAM破坏突变。
质粒消除。编辑验证完成后，酵母在非选择性培养基（YPD）上生长，部分克隆会自然丢失KanMX标记的CRISPR质粒。通过分别点在YPD和YPD+G418平板上，可以在YPD上生长但无法在G418上生长的克隆即为已消除质粒的菌株。
研究结果
论文的预期结果部分给出了清晰的实验读数和数据预期。
转化与筛选的“多vs少”对比。这是整个流程的第一个关键判据。在LiAc/PEG转化和恢复培养后，涂布YPD+G418平板，30°C培养2–3天，含CRISPR质粒和HDR供体的实验组应产生大量菌落，而不含HDR供体的对照组（–HDR donor）只产生极少菌落。这个对比源于Cas9切割的致死性——如果guide有效切割了目标位点，但细胞没有修复模板，DNA双链断裂无法修复，细胞就会死亡。因此，“多vs少”的菌落差异直接验证了两件事：转化和筛选体系工作正常；设计的guide能在目标位点高效切割。原文摘要未提供具体菌落计数数据，但明确指出这一对比是初始读数的核心。
编辑克隆的PCR验证。筛选6–8个菌落进行菌落PCR，用跨越同源臂的引物扩增。正确编辑的克隆应产生预期大小的扩增产物。对于缺失或插入突变，PCR产物会显示相对于未编辑对照的条带位移——缺失导致片段变小，插入导致片段变大。点突变不会改变片段大小，因此需要DNA测序确认。论文强调，成功实验中至少有一部分筛选菌落应为PCR阳性，且DNA测序应确认设计基因型，包括供体中引入的沉默PAM破坏突变。
质粒消除与“治愈”克隆。在非选择性培养基上生长后，部分编辑克隆会丢失KanMX标记的CRISPR质粒。通过YPD和YPD+G418平板对比，可以在YPD上正常生长但无法在G418上生长的克隆即为已消除质粒的菌株。这一步骤的意义在于获得无质粒的纯净编辑菌株，避免残留Cas9活性可能带来的脱靶编辑风险。
讨论与展望
这套PCR引导插入方案的价值在于简化了guide的迭代流程。传统方法更换一个guide需要重新设计酶切位点、重新酶切连接，而PCR方法只需合成一对新引物。对于需要筛选多个guide位点的实验，或者需要构建多个编辑菌株的项目，这种效率提升是实质性的。
论文选择KanMX/G418筛选标记，与酵母中常用的营养缺陷型标记相比，优势在于无需特定的酵母菌株背景——任何对G418敏感的菌株都可以使用。这扩大了方法的适用范围。质粒消除步骤的设计也体现了实用性：编辑完成后不需要繁琐的质粒丢失操作，只需在非选择性培养基上生长即可。
一个值得注意的设计细节是HDR供体中包含沉默PAM破坏突变。Cas9切割需要PAM序列（NGG），如果编辑后PAM序列被破坏，Cas9就无法再次切割已编辑的位点。这种设计可以有效防止Cas9在编辑完成后继续切割目标位点，提高编辑效率的稳定性。这个细节反映出作者对CRISPR编辑机制的深入理解。
对于后续研究而言，这套方法可以直接应用于酵母基因组的各种编辑场景——基因敲除、标签插入、启动子替换等。PCR引导插入的策略也具有一定的通用性，理论上可以适配其他带有可选择标记的Cas9质粒系统。不过，论文中未涉及的具体参数（如LiAc/PEG转化的详细条件、PCR扩增的程序等），在实际操作时可能需要参考原始文献或进行优化。对于希望快速建立酵母CRISPR编辑平台的实验室，这篇protocol提供了一个经过验证的起点。
参考来源
Rostamian H, Madden EW, Kaplan FM, Kim RS, Isom DG. Protocol for CRISPR genome editing in S. cerevisiae using PCR-based guide insertion. STAR Protocols. PMID: 42519825.
PMID: 42519825