来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
RK型人参皂苷是一类具有脱水达玛烷骨架的高价值活性天然产物，但栽培人参中并不天然产生。本研究以东北刺人参（Oplopanax elatus）为对象，结合染色体水平基因组组装、比较基因组学与生化分析，鉴定出专职合成达玛烯二醇的氧化鲨烯环化酶OeOSC14，揭示其经由祖先多功能三萜合酶复制与功能新化而演化。仅一个N260Y氨基酸替换即可使该酶逆转回复为多能三萜合酶。在烟草中重构完整合成通路，首次实现了Rk1、Rk2、Rk3三种RK型人参皂苷的植物源从头合成。
研究背景
植物三萜皂苷是结构高度多样的一类特化代谢产物，已报道超过20000种结构。它们在植物防御病虫害、塑造根际微生物组及影响作物品质方面具有生态功能，同时表现出免疫调节、抗炎和抗癌等药理活性。人参属植物所含人参皂苷以达玛烷骨架为主，在C-3、C-6和/或C-20位发生不同程度糖基化。RK型人参皂苷（Rk1、Rk2、Rk3）为脱水人参皂苷，其达玛烷侧链脱水引入C-20/21或C-20/22双键，疏水性较母体化合物增强。与新鲜人参组织中大量存在的主要人参皂苷不同，RK型人参皂苷在栽培人参中基本不存在，通常仅通过热处理或酸处理（如红参加工蒸制）过程获得。东北刺人参作为人参近缘种，其叶片积累达玛烯二醇——RK型人参皂苷的前体骨架，但该物种本身并不产生RK型人参皂苷。这一矛盾现象为解析RK型人参皂苷生物合成的演化机制提供了独特切入点。
研究方法
植物材料、DNA提取与测序
本研究所用东北刺人参健康个体（3年生）采集自中国黑龙江省哈尔滨市的栽培群体。该群体种植于室外遮阴区域，避免阳光直射。选取新鲜健康植株，小心挖掘使根系完整，迅速清洗后立即投入液氮冷冻，随后于−80 °C保存备用。各组织类型的外观如图1B所示。采用CTAB法从新鲜幼叶中提取高质量DNA。为生成PacBio HiFi长读长数据，取总计15 µg高分子量DNA经gTUBE剪切，随后使用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0构建标准PacBio SMRTbell文库。所得文库经BluePippin系统以15 kb截断值进行大小选择以去除短DNA片段。HiFi共有序列随后在PacBio Sequel II平台上生成。按照标准Illumina文库构建流程构建Hi-C文库，并在MGIseq-2000测序平台上进行定量和测序。
基因组从头组装与质量评估
东北刺人参基因组采用PacBio HiFi读段结合Hi-C数据进行组装。首先，使用SOAPnuke v.1.5.3对原始Hi-C数据进行过滤以获得高质量清洁读段（参数：filter -n 0.01 -l 20 -q 0.4 -d -M 3 -A 0.3 -q 2 -i -G -seqType 1）。HiFi CCS读段使用hifiasm v.0.16.1进行单倍型分型组装，并整合Hi-C数据辅助组装过程。为将contig锚定至染色体，利用Juicer v.1.6和3D-DNA v.180922（参数：-m haploid --early-exit -q20）对Hi-C数据进行过滤、排序和定向。最终，使用Juicebox v.1.11.08对组装结果进行人工校正，修正错误连接并进一步优化contig顺序与方向，获得高质量的染色体水平基因组组装。基因组完整性使用BUSCO v.6.0.0评估。
转座子元件注释
为鉴定东北刺人参基因组中的重复序列，采用从头预测与同源比对相结合的策略。首先，利用LTR_Finder v.1.07、LTRdigest和RepeatModeler v.2.0.7构建非冗余重复序列数据库。随后使用RepeatMasker配合从头预测的重复序列数据库检测重复元件。同源比对方面，使用RepeatMasker和RepeatProteinMask针对Repbase数据库注释已知重复元件。此外，使用TRF v.4.09.1鉴定并注释基因组中的串联重复序列。组装基因组的重复序列注释结果（包括总重复含量及详细家族组成）见补充表8和9。
基因组注释
基因预测整合了三种互补策略：同源预测、从头预测和基于RNA-seq的转录组预测。同源预测方面，将近缘物种蛋白序列使用TBLASTN v.2.2.31+（E-value < 1e-5）比对至组装基因组，随后使用Exonerate v.2.4.0以protein2genome模型（--model protein2genome）鉴定最佳比对结果及对应基因结构。从头预测方面，首先使用RepeatMasker屏蔽基因组中的重复区域，利用同源预测方法获得的基因结构训练HMM模型，随后使用Augustus v.3.5.0基于训练好的HMM模型预测基因结构。转录组预测方面，RNA-seq数据首先使用HISAT2 v.2.2.1比对至基因组，比对读段使用StringTie v.2.2.0组装为转录本，剪接位点经PASA_lite v.0.1.0验证并进一步优化转录本模型。最后，三种方法预测的基因模型使用MAKER2整合生成高质量基因集。功能注释方面，预测基因的蛋白序列使用BLASTP（E-value < 1e-10）与SwissProt、KEGG、KOG和NR数据库比对，基于最佳BLASTP命中结果分配功能注释。
基因组演化分析
比较基因组分析使用东北刺人参及18个其他植物物种：V. vinifera、Arabidopsis thaliana、Populus trichocarpa、A. elata、P. stipuleanatus、P. notoginseng、P. quinquefolium、P. ginseng、P. japonicus、E. senticosus、Daucus carota、Apium graveolens、Coriandrum sativum、Helianthus annuus、Coffea canephora、Solanum lycopersicum、Brachypodium distachyon、Oryza sativa。基因家族使用OrthoFinder v.2.5.5以默认参数聚类。为推断系统发育关系，基于单拷贝基因家族提取四倍简并位点（4D位点），使用RAxML v.8.2.12在GTRGAMMA模型下构建最大似然系统发育树（-m GTRGAMMA -f a -k -#1000，1000次自举重复）。单拷贝直系同源基因的四倍简并位点进一步用于使用PAML v4.9j包中的MCMCTree程序估算物种分化时间。分歧时间在贝叶斯框架下使用马尔可夫链蒙特卡洛算法推断。MCMCTree参数如下：核苷酸替代模型——REV；分子钟模型——相关速率；burn-in迭代——20,000；采样频率——5,000；样本数——20,000。校准点基于TimeTree数据库获得的分歧时间。基因家族扩张与收缩使用CAFE v.4.2分析（-p 0.05 -t 20 -filter）。
对于种内旁系同源基因对，首先使用MCScanX v.1.0.0（-k 50 -s 5 -e 1e-05 -m 25）鉴定共线性区块，区块内基因对间的Ks值使用PAML中的codeml在F3X4模型下计算。种间直系同源基因对通过BLASTP（E-value < 1e-5）鉴定，基于bit-score和E-value排名选择最佳命中基因对，使用PAML计算Ks值。
候选基因鉴定
基因家族预测使用HMMER v.3.1b2基于Pfam模型进行：OSC使用PF13243和PF13249，CYP使用PF00067，UGT使用PTHR48047，E-value阈值<0.01。预测的蛋白序列使用SeqKit v.2.6.1软件按长度进一步筛选：OSC为500–900个氨基酸，CYP和UGT为400–600个氨基酸。筛选后的基因家族成员使用在线工具Conserved Domain Database验证。
系统发育分析
为推断OSC、CYP和UGT基因家族的系统发育历史并确定其亚家族分类，使用植物中已报道功能的基因序列与东北刺人参预测家族成员进行系统发育分析。分析所用全部序列见补充数据3–6。多序列比对使用MAFFT v.7.518以默认参数进行。最大似然系统发育树使用FastTree v.2.2软件在默认设置下重建。所得Newick格式树使用iTOL在线平台可视化和注释。
植物基因表达载体构建
使用EasyPure® Plant RNA Kit提取总RNA（原文未详述具体步骤）。
研究结果
东北刺人参叶片积累达玛烯二醇但不产生RK型人参皂苷
东北刺人参以富含三萜皂苷著称，以往对根和根茎提取物的研究主要报道齐墩果烷型和羽扇豆烷型三萜类化合物。为考察东北刺人参中三萜骨架的多样性和组织特异性分布，作者对根、茎、根茎、叶和叶柄的提取物进行了基于GC–MS的代谢物谱分析（图1B）。通过与真实三萜标准品的保留时间和质谱碎裂模式比对，检测到包括桦木醇、桦木酸、β-香树脂醇、α-香树脂醇和达玛烯二醇II在内的多种化合物（图1C；补充图1）。值得注意的是，叶片提取物在m/z 189的总离子流色谱图和提取离子流色谱图中，于37.15 min处出现一个显著未知产物峰（P1），其强度最高（图1C；补充图2）。该化合物的质谱特征不同于α-香树脂醇、β-香树脂醇或羽扇豆醇，无法据此确定结构（图1D）。因此，作者对叶片中的P1进行了大规模提取、分离和纯化，并通过核磁共振波谱确定其结构为达玛-20,24-二烯-3β-醇（达玛烯二醇）（补充图3–8；补充数据1）。随后，为评估东北刺人参是否积累RK型人参皂苷，使用人参皂苷Rk1、Rk2和Rk3的商业化标准品进行靶向LC–MS分析。在叶片或其他任何检测组织中均未检测到这三种人参皂苷（图1E-G；补充图9）。综上，东北刺人参在叶片中积累RK型前体骨架达玛烯二醇，但在各组织中均未检测到RK型人参皂苷（Rk1–Rk3）的产生。
东北刺人参基因组的测序、组装与注释
为探索达玛烯二醇生物合成的基因组基础，作者构建了异源四倍体东北刺人参（2n = 4x = 48）的染色体水平基因组组装。东北刺人参单倍型基因组大小估计为762 Mb，杂合度高达8.5%（补充图10）。共生成45.76 Gb（约30×）PacBio HiFi读段和126.91 Gb（约71×）Hi-C读段用于组装（补充表1–2）。从头组装包含964个contig，N50长度为7.5 Mb，总组装大小为1.49 Gb（补充表3）。通过染色体锚定，最终组装包含两个单倍型，锚定至24条假染色体，总计1.45 Gb（约占基因组的97.4%），contig N50为7.5 Mb，BUSCO完整性高达99.38%（图2A；补充图11、12；补充表3–5）。基因组注释鉴定出覆盖组装序列63.68%的重复序列，预测到61,842个高置信度蛋白编码基因，其中92.01%获得功能注释（补充表6–9）。
系统发育分析与全基因组复制事件
为解析五加科演化历史及东北刺人参的系统发育位置，作者分析了19个代表性植物基因组，包括8个五加科物种。使用145个单拷贝基因构建的最大似然树将五加科分为两个强支持分支：一支包含刺五加（Eleutherococcus senticosus）和东北刺人参，另一支包含辽东楤木（Aralia elata）及5个人参属物种。该拓扑结构表明东北刺人参与刺五加的亲缘关系比与辽东楤木或人参属物种更近。值得注意的是，刺五加的亚基因组A和B形成两个独立分支，分别与东北刺人参的亚基因组A和B聚类，这与两者共享涉及两个分歧祖先谱系的异源多倍化起源一致。异源四倍体人参属物种中也观察到类似的双亚基因组模式，且B亚基因组与二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）表现出更高相似性，提示B亚基因组可能源自一个类似二倍体五加科的祖先（图2B）。
基于相同116个直系同源群组的MCMCTREE分歧时间估算（使用TimeTree化石校准）将五加科与伞形科的分化定在约68.2百万年前，两个主要五加科谱系的随后分离约在28.5百万年前。重要的是，东北刺人参亚基因组A和B的分化约在23.2百万年前，早于辽东楤木-人参属分支内的物种分化（图2B）。随后比较候选植物基因组以获得在东北刺人参中显著扩张或特有的基因家族。GO和KEGG富集分析显示，扩张家族在三萜代谢过程（GO）和倍半萜及三萜生物合成（KEGG）中过度代表，与该物种丰富的三萜化学特征一致（补充图13–14）。
全基因组复制是植物基因家族多样化和代谢创新的主要驱动力。作者因此分析了东北刺人参、刺五加、人参、三七和辽东楤木中旁系同源基因对的同义替代率（Ks）分布。这些分析揭示了约0.3和约0.1处的两个显著峰（图2C）。在五加科物种中，Ks ≈ 0.3处的共享峰指示一个共同的全基因组复制事件（Pg-β）。这一推断进一步得到二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）与葡萄之间2:1共线性关系的支持（补充图15）。此外，包括东北刺人参、刺五加和人参在内的异源四倍体物种表现出二倍体物种中不存在的约0.1处额外Ks峰。每个异源四倍体内两个亚基因组之间的直系同源基因对也显示约0.1处的峰。与此模式一致，共线性分析揭示了葡萄、辽东楤木、人参和东北刺人参之间的1:2:4:4关系，支持五加科在共享全基因组复制事件后发生了相对较近的异源多倍化事件（图2D；补充图16）。
东北刺人参中功能性达玛烯二醇合酶的鉴定
鉴于达玛烯二醇在东北刺人参叶片中积累，作者假设东北刺人参基因组编码一种特异性催化2,3-氧化鲨烯环化生成达玛烯二醇的氧化鲨烯环化酶。为验证该假设，使用已知人参OSC序列作为查询对东北刺人参基因组进行BLAST搜索。在排除短于600个氨基酸的不完整蛋白后，鉴定出19个全长推定OSC基因（OeOSC1–OeOSC19）。
系统发育分析显示，OeOSC14与已知的多功能三萜合酶——如催化β-香树脂醇、α-香树脂醇和羽扇豆醇生成的酶——聚在同一分支，但处于一个独立亚支。为验证OeOSC14的功能，作者在烟草叶片中瞬时共表达OeOSC14与tHMGR（截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶），GC–MS分析显示其主要产物为达玛烯二醇，另有少量达玛烯二醇II。值得注意的是，OeOSC14的产物谱与已知的多功能三萜合酶截然不同——后者通常同时产生多种五环三萜和四环三萜，而OeOSC14几乎专一性地产生达玛烯二醇（图3E）。这一结果表明OeOSC14是一个专职化的达玛烯二醇合酶。
OeOSC14的演化机制与关键氨基酸位点
为解析OeOSC14功能特化的分子基础，作者对OeOSC14与代表性OSC进行了多序列比对和分子对接分析。序列比对显示，OeOSC14的第260位为天冬酰胺（N），而大多数多功能三萜合酶在该位置为酪氨酸（Y）。分子对接模型表明，该残基位于活性口袋内部，与底物和产物的空间排布密切相关。作者构建了OeOSC14的N260Y突变体，发现该单点突变使OeOSC14从达玛烯二醇专一性酶逆转回复为多功能三萜合酶，重新获得产生β-香树脂醇、α-香树脂醇和达玛烯二醇II的能力。相反，将多功能合酶SbχAS的Y259突变为天冬酰胺（Y259N），则使其从多功能合酶转变为以达玛烯二醇为主要产物的专一性酶。同样，OeOSC12的Y260N突变也导致功能向达玛烯二醇合酶方向转变。这些结果证明第260位（或对应位置）的单个氨基酸残基是决定OSC产物特异性的关键开关，其从酪氨酸到天冬酰胺的替换驱动了达玛烯二醇合酶的功能新化。
RK型人参皂苷生物合成通路的重构
东北刺人参积累达玛烯二醇但不产生RK型人参皂苷，提示其下游氧化步骤可能存在缺陷。作者对C12-羟化酶基因家族进行了系统发育分析和跨物种共线性分析，发现东北刺人参基因组中CYP716A47（人参中催化达玛烷型皂苷C-12羟化的关键酶）的直系同源基因发生了功能缺失突变，无法催化达玛烯二醇的C-12羟化步骤。这一功能缺失阻断了RK型人参皂苷生物合成所必需的下游氧化修饰。
为验证这一假设并实现RK型人参皂苷的异源生物合成，作者在烟草叶片中进行了系统的通路重构实验。首先共表达tHMGR、OeOSC14、PgCYP716A47和PgCYP716A53v2，GC–MS分析检测到C-12羟化产物的生成（图7A）。进一步引入UGT基因后，LC–MS分析在m/z 665.430处检测到人参皂苷Rk3的产物峰（图7B），在m/z 649.435和811.488处分别检测到人参皂苷Rk2和Rk1的产物峰（图7C）。MS碎裂谱确认了三种产物的结构（图7D）。定量分析显示，在烟草叶片中，人参皂苷Rk1、Rk2和Rk3的异源生物合成产量分别为（原文未给出具体数值，以图表呈现）。
讨论与解读
本研究通过染色体水平基因组组装和比较基因组学分析，揭示了东北刺人参中达玛烯二醇合酶OeOSC14的演化路径——其经由祖先多功能三萜合酶的复制与功能新化而产生。单个N260Y氨基酸替换即可逆转该酶的产物特异性，这一发现为三萜合酶的产物多样性演化提供了精确的分子机制解释。同时，C12-羟化酶的功能缺失解释了东北刺人参虽积累前体骨架却不产生RK型人参皂苷的矛盾现象。在烟草中成功重构RK型人参皂苷的完整生物合成通路，实现了Rk1、Rk2、Rk3的植物源从头生产。
编译者解读
该研究体现了合成生物学中"解析自然—重构通路"的经典范式。从基因组数据中挖掘关键酶并鉴定功能开关氨基酸，为三萜合酶的理性设计提供了直接靶点。值得注意的是，N260Y这种单点突变即可翻转产物谱的现象，提示自然界中三萜骨架多样化的演化路径可能比预想更为经济。在应用层面，烟草瞬时表达系统虽已实现RK型人参皂苷的从头合成，但产量仍处于较低水平，距离商业化生产尚有距离。后续工作可聚焦于酶工程优化、代谢流平衡及稳定转化体系的建立。此外，该研究也为其他脱水人参皂苷类化合物的绿色生物制造提供了可借鉴的酶元件和通路设计策略。
参考来源
Wang X, Zhang H, Kang M, An Z, Song Y. The Oplopanax elatus genome reveals dammaradienol synthase evolution enabling reconstruction of RK type ginsenosides biosynthesis. Nature Communications. PMID: 42342661.
PMID: 42342661