来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
自然界通过酶在微区室中的有序组织实现高效生物合成，受此启发，多酶级联催化成为生产复杂分子的重要途径。然而，酶不相容性、底物传递效率低和催化剂回收困难长期制约实际应用。本研究报道了一种在Pickering乳液中运行的活体生物催化平台——通过可调超分子化学将油基光催化剂接枝到过表达酶的工程大肠杆菌表面，形成两亲性“超细菌”，自组装于水-油界面稳定乳液。该平台将化学催化与生物催化整合，反应速率较传统双相体系最高提升45倍，支持单步、序贯和一锅法级联反应，并实现了克级苯偶姻合成。
研究背景
自然界中多酶级联催化系统代表了化学制造的巅峰——将简单前体转化为复杂高值分子，兼具无与伦比的精确性和效率。这种生物装配线通过将多种酶组织在特定细胞微环境中实现其优雅功能，克服了底物扩散、竞争反应和催化剂降解等难题。将这一概念转化到工业规模合成，有望推动更可持续的化学工业发展，在温和水相条件下实现原子经济性路线。全细胞生物催化利用工程微生物作为自包含、自复制的微工厂，避免了昂贵的酶纯化步骤，并在原位提供必要辅因子，因此极具吸引力。
然而，全细胞生物催化的广泛应用，尤其涉及疏水底物或产物的多步级联反应，仍面临显著障碍。主要挑战包括水相细胞环境与不互溶有机相之间跨相界的传质效率低下，导致反应速率缓慢；许多级联反应需要生物催化剂与化学催化剂协同（化学酶法反应），而两者往往在互不相容的条件下操作；此外，有机溶剂的直接接触可能损害细胞活力。
研究方法
材料
商业化学品未经进一步纯化直接使用。大肠杆菌（BL21(DE3)）菌株购自Thermo Fisher Scientific。细胞培养和酶表达方法详见补充信息。
油基催化剂（OBC）的合成
ⅰ）油基催化剂PFA的合成
首先，将棕榈油（88.5 g，0.1 mol）倒入烧瓶中，置于100 °C油浴中脱气1小时。随后，冷却至60 °C后通过注射加入2-（甲氨基）乙醇（30.4 g，0.4 mol）和甲醇钠（0.6 mL，3 mmol）。反应密封过夜。12小时后，额外加入甲醇钠（0.6 mL，3 mmol），继续反应6小时。粗产物冷却至室温，用二氯甲烷（DCM）稀释。用饱和氯化钠溶液洗涤至有机相澄清。有机相用硫酸镁干燥，旋转蒸发除去溶剂，得到纯PFA。
ⅱ）油基催化剂OBC的合成
将PFA（1.5 g，4.4 mmol）、蒽醌-2-羧酸（1.0 g，4 mmol）和4-（二甲氨基）吡啶（DMAP，0.5 g，4.4 mmol）溶解于20 mL DCM中。待完全溶解后，在冰浴中逐滴加入N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC，0.9 g，4.4 mmol），反应过夜。产物过滤后，旋转蒸发除去溶剂，粗产物（有机相）经柱色谱纯化（乙酸乙酯：石油醚 = 1:3）。纯产物（OBC）为淡黄色固体。
胺化CD（ACD）的合成
首先，将β-环糊精（β-CD，25.0 g，22.0 mmol）溶解于250 mL 0.4 M氢氧化钠溶液中，冰浴冷却至5 °C以下。随后，在剧烈搅拌下于5 min内逐渐加入对甲苯磺酰氯（17.5 g，92 mmol）。反应混合物在5 °C持续搅拌30 min，然后过滤。所得滤液用浓盐酸中和，继续搅拌1 h。收集沉淀，用水充分洗涤（三次），60 °C干燥过夜，得到7.1 g白色固体，即OTs-CD。
第二步，将4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺（3.4 g，15.4 mmol）和OTs-CD（4.0 g，3.1 mmol）溶解于10 mL无水N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中，随后加入碘化钾（KI，50 mg，0.3 mmol）。反应混合物在惰性无水气氛下于70 °C搅拌过夜。反应完成后，黄色溶液冷却至室温，用200 mL乙醇稀释。收集沉淀，依次用乙醇和乙醚洗涤，经柱色谱进一步纯化（乙腈：H₂O：氨水 = 1:1:0.2）。最后，纯化产物在50 °C真空干燥过夜，得到2.6 g白色固体，即胺化CD（ACD）。
共轭物（cell@OBC）的制备
ⅰ）共轭物（cell@CD）的制备
新鲜收集的大肠杆菌分散于40 mL磷酸钾缓冲液（KPI缓冲液，pH 8.0，0.1 M）中，终OD600为2.0。将ACD（10 mM）、EDC（18 mM）和NHS（14 mM）一起加入大肠杆菌分散液中，4 °C反应12小时获得粗产物。反应结束后，用KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤三次，除去过量游离ACD和未反应试剂。离心收集产物，最终共轭物（cell@CD）悬浮于KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，终OD600为2.0，备用。
ⅱ）共轭物（cell@OBC）的制备
收集的cell@CD分散于40 mL KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，终OD600为2.0。随后，将溶解于4 mL DMSO中的OBC（10 mM）加入上述缓冲液中，4 °C反应过夜。反应结束后，用含10% DMSO的KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤3次，除去过量游离OBC。离心收集产物（cell@OBC）。
不同大肠杆菌的界面催化
将0.6 mL过表达不同酶的cell@OBC溶液与0.4 mL有机溶液混合，用手摇法制备乳液。随后，在乳液中加入100 mM底物启动反应。每隔一定时间，取20 μL混合物，用180 μL乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥。离心后，取150 μL上清液进行气相色谱测量。所有实验均进行三次重复。
报告摘要
研究设计的更多信息见Nature Portfolio Reporting Summary。
研究结果
活体两亲性生物催化剂的设计与合成
研究从关键组件的模块化合成开始：胺化β-环糊精（ACD）宿主和定制的OBC客体（补充图1）。两种分子的成功合成和纯度经¹H NMR、TLC-MS和FTIR光谱严格确认（补充图2、3、4和5）。获得这些构建模块后，研究继续对活体大肠杆菌BL21（DE3）细胞表面进行工程改造。“超细菌”颗粒的构建是在温和、生物相容条件下执行的两步过程。首先，通过偶联剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将ACD宿主共价接枝到细胞表面，得到cell@CD共轭物（补充图6）。第二步，引入OBC客体，通过环糊精空腔内的主客体包合自发组装到细胞表面，形成最终的cell@OBC颗粒。OBC的成功非共价附着通过UV-Vis光谱确认——cell@OBC在330 nm处显示蒽醌部分的特征吸收，而天然细胞和游离OBC的对照混合物中不存在该峰（补充图7）。这一结果为稳定的超分子连接提供了明确证据。关键的是，研究验证了蒽醌单元的光催化活性不因其共轭到OBC结构中而受阻，为后续研究提供了极佳的起点（补充图8）。
为可视化表面修饰并优化其密度，研究使用金刚烷标记的荧光素染料（AM-FITC）对cell@CD共轭物进行荧光标记，该染料特异性结合表面接枝的环糊精空腔（图2a）。设计的一个核心原则是在保持细胞活力和功能的同时调节表面化学。通过改变偶联试剂（EDC/NHS）的浓度，可以精确控制细胞表面β-CD的密度，通过相应的荧光强度增加进行定量（图2b）。同时，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示cell@CD共轭物周围有清晰的绿色荧光，而天然细胞或仅与染料混合的对照细胞上没有荧光，证实了β-CD宿主的成功共价附着（图2c）。此外，修饰细胞与天然细胞之间的失重差异单调增加，揭示了表面接枝的可调性（图2d和补充图9）。随后，通过ζ电位表征表面电荷，显示随着超分子负载量增加，从天然细胞的−45 mV逐渐变化至−6 mV（图2e和补充图10）。这些发现表明，细胞表面的超分子层可以被精确调控，以适应不同的功能需求。
然而，这种功能化揭示了表面修饰程度与胞内酶活性保留之间的反比关系。研究使用过表达苯甲醛裂解酶（BAL）的大肠杆菌评估对胞内酶功能的影响，发现过度的表面功能化虽然增加了疏水性，却显著降低了酶的保留活性（图2f）。这种下降可能归因于致密表面层造成的传质限制或潜在的化学应激。相反，功能化不足则无法提供稳定乳液所需的足够两亲性（图2f，插图）。通过系统优化，研究确定18 mM EDC和14 mM NHS的偶联条件达到最佳平衡——赋予稳健的乳化性能，同时保持超过97%的胞内酶活性。为进一步确认超分子层附着到细胞表面不会引入额外的传质屏障，研究裂解cell@OBC释放游离BAL酶，并将其活性与cell@OBC和天然细胞进行比较。结果显示三者之间几乎没有差异（图2g和补充图11），有力支持了研究假设，为后续研究奠定了坚实基础。
增强的细胞稳健性和生物相容性
全细胞催化的一个关键优势是细胞为酶提供的保护环境。研究假设表面修饰将进一步保护细胞免受过程中常见的严苛条件影响。为验证这一点，研究将cell@OBC共轭物置于热和化学应激条件下。当暴露于45 °C两小时时，cell@OBC保留了初始胞内BAL活性的69.6%，比未修饰的天然细胞提高了2.4倍（图3a）。更引人注目的是，当面对甲苯-水界面——一种以诱导细胞裂解著称的条件——cell@OBC共轭物在两小时后维持了52.2%的活性，而天然细胞的活性显著下降，稳定性提升了2.8倍（图3b）。研究还测试了N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、异丙醇和二甲基亚砜（DMSO）等其他溶剂，进一步巩固了聚合物对有机溶剂的保护作用（补充图12）。此外，经过2小时紫外线照射后，cell@OBC的保留活性仍比天然细胞高2.1倍（图3c和补充图13）。这些发现通过活/死染色测定得到佐证，该测定直观显示了cell@OBC共轭物在热和有机溶剂应激下相比天然对应物的优越存活率（图3d-i）。
讨论与解读
本研究报道的活体生物催化平台通过可调超分子表面化学将油基光催化剂锚定于工程大肠杆菌表面，形成两亲性“超细菌”，在Pickering乳液中自组装于水-油界面。该策略实现了化学催化剂与生物催化剂的空间邻近组织，使反应速率较传统双相体系最高提升45倍。平台支持单步、序贯和一锅法级联反应，包括克级苯偶姻合成。动态超分子连接还实现了按需双模式回收：活性细胞共轭物可重复使用，或选择性回收合成催化剂并重新附着到新鲜细胞上。值得注意的是，18 mM EDC和14 mM NHS的优化偶联条件在保持超过97%胞内酶活性的同时赋予稳健乳化性能；45 °C热处理2小时后cell@OBC保留69.6%初始活性（天然细胞仅约29%）；甲苯-水界面应激下cell@OBC维持52.2%活性，为天然细胞的2.8倍。
编译者解读
该研究巧妙运用主客体超分子化学，在活细胞表面构建可编程的“分子接口”，解决了全细胞催化中生物-化学催化剂不相容的长期难题。从合成生物学应用视角看，其价值不仅在于45倍的速率提升，更在于建立了“表面修饰密度-细胞活力-催化效率”的定量关系窗口——这为其他活体催化系统的界面工程设计提供了方法论模板。局限性在于当前优化主要针对BAL等特定酶系，不同酶对表面修饰的耐受性可能差异显著；此外，5 L放大实验中细胞长期操作稳定性数据原文未详述。未来若能将此超分子策略推广至更多天然产物生物合成途径，有望构建真正意义上的“细胞工厂装配线”。
PMID: 42342679