来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
RK型人参皂苷是一类具有脱水达玛烷结构的稀有皂苷，具有重要生物活性，但在栽培人参中天然不产生。本研究组装了东北刺人参（Oplopanax elatus）染色体级别基因组，发现其叶片积累达玛二烯醇——RK型人参皂苷的前体骨架——却不产生RK型皂苷。通过比较基因组学与生化分析，研究者鉴定出OeOSC14为特化的达玛二烯醇合酶，并揭示其由多功能三萜合酶经基因复制和新功能化演化而来。单氨基酸替换N260Y即可逆转该酶的底物特异性。在烟草中重构完整通路，实现了Rk1、Rk2、Rk3的从头合成。
研究背景
植物来源的三萜皂苷是一类重要的次生代谢产物，以C30骨架为核心并经糖基修饰，结构多样性极高，已报道超过20,000种。它们不仅具有抵御病虫害、塑造根际微生物组等生态功能，还展现免疫调节、抗炎及抗癌相关活性。人参属植物富含数百种结构各异的人参皂苷，主要以达玛烷为骨架，在C-3、C-6和/或C-20位发生糖基化。RK型人参皂苷（Rk1、Rk2、Rk3）属于脱水人参皂苷家族，在达玛烷侧链上引入C-20/21或C-20/22双键，疏水性增强。与新鲜人参组织中占主导的常规皂苷不同，RK型皂苷在栽培人参中几乎不存在，通常通过热或酸处理（如红参加工）获得。东北刺人参作为人参近缘种，可积累达玛二烯醇——RK型皂苷的前体骨架，却不产生RK型皂苷——这为解析RK型皂苷生物合成的进化机制提供了独特体系。
研究方法
植物材料、DNA提取与测序
本研究所用东北刺人参健康个体（3年生）采集自中国黑龙江省哈尔滨市的栽培种群。种群栽培于室外遮阴区域，避免阳光直射。选取新鲜健康植株，小心从土壤中挖出并保持根系完整，快速清洗后立即用液氮冷冻，于−80 °C保存备用。各组织类型的外观如图1B所示。
采用CTAB法从新鲜幼叶中提取高质量DNA。为获得PacBio HiFi长读长数据，共取15 µg高分子量DNA，使用gTUBE剪切，随后用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0构建标准PacBio SMRTbell文库。所得文库使用BluePippin系统进行大小筛选，截断值为15 kb以去除短DNA片段。HiFi一致性序列在PacBio Sequel II平台上生成。按标准Illumina文库构建流程制备文库后，Hi-C文库在MGIseq-2000测序平台上进行定量和测序。
基因组从头组装与质量评估
东北刺人参基因组使用PacBio HiFi读段结合Hi-C数据进行组装。首先，使用SOAPnuke v.1.5.3对原始Hi-C数据进行过滤以获得高质量clean reads（参数：filter -n 0.01 -l 20 -q 0.4 -d -M 3 -A 0.3 -q 2 -i -G -seqType 1）。HiFi CCS读段使用hifiasm v.0.16.1组装成单倍型分型contigs，并整合Hi-C数据辅助组装过程。为将contigs锚定到染色体上，利用Juicer v.1.65和3D-DNA v.180922（参数：-m haploid --early-exit -q20）处理Hi-C数据，执行contigs的过滤、排序和定向。最后，使用Juicebox v.1.11.08手动校正组装结果，修正错误连接并进一步细化contig顺序和方向，获得高质量的染色体水平基因组组装。基因组完整性使用BUSCO v.6.0.0评估。
转座子元件注释
为鉴定东北刺人参基因组中的重复序列，采用从头预测和同源比对相结合的策略。首先，使用LTR_Finder v.1.07、LTRdigest和RepeatModeler v.2.0.7构建非冗余重复序列数据库。随后应用RepeatMasker结合从头预测的重复序列数据库检测重复元件。在同源比对方面，使用RepeatMasker和RepeatProteinMask比对Repbase数据库以注释已知重复元件。此外，使用TRF v.4.09.1鉴定并注释基因组中的串联重复序列。组装基因组的重复序列注释结果（包括总重复含量和详细的家族组成）见补充表8和9。
基因组注释
基因预测整合了三种互补策略：同源预测、从头预测和基于RNA-seq数据的转录组预测。同源预测方面，将近缘物种的蛋白序列使用TBLASTN v.2.2.31+（E-value < 1e-5）比对到组装基因组。随后使用Exonerate v.2.4.0以protein2genome模型（--model protein2genome）鉴定最佳比对结果和对应基因结构。从头预测方面，先用RepeatMasker屏蔽基因组中的重复区域，再利用同源预测方法得到的基因结构训练HMM模型，随后使用Augustus v.3.5.0基于训练好的HMM模型预测基因结构。转录组预测方面，先用HISAT2 v.2.2.1将RNA-seq数据比对到基因组，再用StringTie v.2.2.1将比对读段组装成转录本。使用PASA_lite v.0.1.0验证剪接位点并进一步优化转录本模型。最后，使用MAKER2整合三种方法预测的基因模型，生成高质量基因集。功能注释方面，使用BLASTP（E-value < 1e-10）将预测基因的蛋白序列比对到SwissProt、KEGG、KOG和NR数据库，基于最佳BLASTP命中结果赋予功能注释。
基因组进化分析
比较基因组分析使用东北刺人参及18个额外植物物种：V. vinifera、Arabidopsis thaliana、Populus trichocarpa、A. elata、P. stipuleanatus、P. notoginseng、P. quinquefolium、P. ginseng、P. japonicus、E. senticosus、Daucus carota、Apium graveolens、Coriandrum sativum、Helianthus annuus、Coffea canephora、Solanum lycopersicum、Brachypodium distachyon、Oryza sativa。使用OrthoFinder v.2.5.5以默认参数聚类基因家族。为推断系统发育关系，基于单拷贝基因家族提取phase 1或四倍简并（4D）位点，使用RAxML v.8.2.12在GTRGAMMA模型下构建最大似然（ML）系统发育树，1000次bootstrap重复（-m GTRGAMMA -f a -k -#1000）。进一步使用单拷贝直系同源基因的四倍简并位点，通过PAML v4.9j包中的MCMCTree程序估算物种分化时间。分化时间在贝叶斯框架下用马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）算法推断。MCMCTree使用参数如下：核苷酸替代模型——REV；分子钟模型——相关速率；burn-in迭代——20,000；采样频率——5,000；样本数——20,000。校准点基于TimeTree数据库获得的分化时间。基因家族扩张与收缩使用CAFE v.4.2.1分析（-p 0.05 -t 20 -filter）。
对于种内旁系同源基因对，先使用MCScanX v.1.0.0（-k 50 -s 5 -e 1e-05 -m 25）鉴定共线性区块，再使用PAML中的codeml在F3X4模型下计算各共线性区块内基因对间的Ks值。种间直系同源基因对通过BLASTP（E-value < 1e-5）鉴定，基于bit-score和E-value排序选择最佳命中基因对，用PAML计算Ks值。
候选基因鉴定
基因家族预测使用HMMER v.3.1b2，基于Pfam模型PF13243和PF13249（OSC）、PF00067（CYP）和PTHR48047（UGT）在东北刺人参中进行，E-value阈值<0.01。预测的蛋白序列进一步用SeqKit v.2.6.1软件按长度过滤：OSC为500–900个氨基酸，CYP和UGT为400–600个氨基酸。过滤后的基因家族成员用在线工具Conserved Domain Database进行验证。
系统发育分析
为推断OSC、CYP和UGT等基因家族的系统发育历史并确定其亚家族分类，使用植物中已报道功能的基因序列连同东北刺人参的预测家族成员进行系统发育分析。分析所用全部序列列于补充数据3–6。使用MAFFT v.7.518以默认参数进行多序列比对。使用FastTree v.2.2软件在默认设置下重建最大似然（ML）系统发育树。所得Newick格式树使用Interactive Tree Of Life（iTOL）在线平台进行可视化和注释。
植物基因表达载体构建
使用EasyPure® Plant总RNA提取试剂盒提取总RNA。
研究结果
东北刺人参叶片积累达玛二烯醇但不产生RK型人参皂苷
东北刺人参以富含三萜皂苷著称，先前对根和根茎提取物的研究主要报道齐墩果烷型和羽扇豆烷型三萜。为考察东北刺人参三萜骨架的多样性和组织特异性分布，研究者对根、茎、根茎、叶和叶柄的提取物进行了基于气相色谱-质谱联用（GC–MS）的代谢物谱分析（图1B）。通过与真实三萜标准品的保留时间和质谱碎裂模式比对，检测到多种化合物，包括桦木醇、桦木酸、β-香树脂醇、α-香树脂醇和达玛烯二醇II（图1C；补充图1）。值得注意的是，叶片提取物的总离子流色谱图（TICs）和m/z 189提取离子流色谱图（EICs）在37.15分钟处显示一个突出的未知产物峰（P1），强度最高（图1C；补充图2）。该化合物的质谱特征与α-香树脂醇、β-香树脂醇或羽扇豆醇均不同，无法据此鉴定结构（图1D）；因此，研究者对叶片中P1进行了大规模提取、分离和纯化，并通过核磁共振（NMR）波谱测定其结构，鉴定为达玛-20,24-二烯-3β-醇（达玛二烯醇）（补充图3–8；补充数据1）。接下来，为评估RK型人参皂苷是否在东北刺人参中积累，使用Rk1、Rk2和Rk3人参皂苷的商业化标准品进行了靶向LC–MS分析。这三种皂苷在叶片或任何其他检测组织中均未检出（图1E–G和补充图9）。综上，这些结果表明东北刺人参在叶片中积累RK前体骨架达玛二烯醇，但在各组织中均未检测到RK型人参皂苷（Rk1–Rk3）的产生。
东北刺人参的基因组测序、组装与注释
为探索达玛二烯醇生物合成的基因组基础，研究者生成了异源四倍体东北刺人参（2n = 4x = 48）的染色体水平基因组组装。东北刺人参的单倍型基因组大小估计为762 Mb，杂合率为8.5%（补充图10）。共生成45.76 Gb（约30×）PacBio HiFi读段和126.91 Gb（约71×）Hi-C读段用于组装（补充表1–2）。从头组装包含964个contigs，N50长度为7.5 Mb，总组装大小为1.49 Gb（补充表3）。通过染色体锚定，最终组装包含锚定到24条假染色体上的两个单倍型，总计1.45 Gb（约占基因组的97.4%），contig N50为7.5 Mb，BUSCO完整性高达99.38%（图2A；补充图11、12；补充表3–5）。基因组注释鉴定出覆盖组装序列63.68%的重复序列，预测了61,842个高置信度蛋白编码基因，其中92.01%获得了功能注释（补充表6–9）。
东北刺人参的系统发育分析与全基因组复制事件
为解析五加科的进化历史及东北刺人参的系统发育位置，研究者分析了19个代表性植物基因组，包括8个五加科物种。使用145个单拷贝基因构建的最大似然树将五加科分为两个高支持率分支：一支包含刺五加（Eleutherococcus senticosus）和东北刺人参，另一支包含辽东楤木（Aralia elata）及5个人参属物种。这一拓扑结构表明东北刺人参与刺五加的亲缘关系比与辽东楤木或人参属更近。值得注意的是，刺五加的亚基因组A和B形成了两个独立分支，分别与东北刺人参的亚基因组A和B聚在一起，与涉及两个分化祖先谱系的共享异源多倍化起源一致。异源四倍体人参属物种中也观察到类似的亚基因组模式，且B亚基因组与二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）表现出更高的相似性，提示B亚基因组可能来源于一个类似二倍体五加科的祖先（图2B）。
基于相同116个直系同源群（使用TimeTree化石校准）的MCMCTREE分化时间估算将五加科与伞形科的分歧定在约68.2百万年前，两个主要五加科谱系的随后分离约在28.5百万年前；重要的是，东北刺人参的亚基因组A和B约在23.2百万年前分化，早于辽东楤木-人参属分支内的物种分化（图2B）。随后比较候选植物物种的基因组，以获得在东北刺人参中显著扩张或东北刺人参特有的基因家族。GO和KEGG富集分析显示，扩张家族在三萜代谢过程（GO）和倍半萜及三萜生物合成（KEGG）中过度表达，与该物种丰富的三萜化学特征一致（补充图13–14）。
全基因组复制（WGD）是植物基因家族多样化和代谢创新的主要驱动力。因此，研究者分析了东北刺人参、刺五加、人参、三七和辽东楤木中旁系同源基因对的同义替代率（Ks）分布。这些分析揭示了约0.3和约0.1处两个显著峰（图2C）。在五加科物种中，Ks≈0.3处的共享峰指示一个共同的WGD事件（Pg-β）。这一推断进一步得到二倍体五加科基因组（如三七和辽东楤木）与Vitis vinifera之间2:1共线性关系的支持（补充图15）。此外，包括东北刺人参、刺五加和人参在内的异源四倍体物种在约0.1处呈现一个额外的Ks峰，而二倍体物种中没有。每个异源四倍体两个亚基因组间的直系同源基因对也显示约0.1处的峰。与此模式一致，共线性分析揭示了V. vinifera、辽东楤木、人参和东北刺人参之间的1:2:4:4关系，支持五加科在一次共享的WGD之后发生了较近的异源多倍化事件（图2D；补充图16）。
东北刺人参中功能性达玛二烯醇合酶的鉴定
鉴于达玛二烯醇在东北刺人参叶片中的积累，研究者假设东北刺人参基因组编码一种氧化角鲨烯环化酶（OSC），特异性催化2,3-氧化角鲨烯环化形成达玛二烯醇。为验证这一假设，使用已知的人参OSC序列作为查询序列对东北刺人参基因组进行BLAST搜索。排除短于600个氨基酸的不完整蛋白后，鉴定出19个全长推定OSC基因（OeOSC1–OeOSC19）。
通过系统发育分析，这些OSC基因被分类到不同的OSC亚家族中。为确定各OeOSC基因的功能，研究者将每个OeOSC基因与tHMGR（截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶）一起在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中瞬时共表达，通过GC–MS分析检测产物。结果显示，OeOSC14催化产生一种主要产物，其保留时间和质谱碎裂模式与达玛二烯醇标准品一致；而其他OeOSC基因则产生β-香树脂醇、α-香树脂醇、羽扇豆醇或达玛烯二醇II等不同产物。基于此，OeOSC14被鉴定为达玛二烯醇合酶。
OeOSC14的进化起源与关键氨基酸位点
为解析OeOSC14的进化起源，研究者对双子叶植物中已功能鉴定的OSC以及来自V. vinifera、S. barbata、A. argyi、C. asiatica和8个五加科物种的所有预测OSC进行了最大似然系统发育分析。结果显示，OeOSC14属于一个包含多功能三萜合酶（mTTS）的亚家族。基因拷贝数分析表明，达玛烯二醇合酶（DDS）亚家族在五加科中经历了谱系特异性的扩张。共线性分析显示，OeOSC14所在的基因组区域与其他人参属物种中的DDS基因存在微共线性关系。这些结果表明，OeOSC14可能由一个祖先的多功能三萜合酶基因经复制和新功能化演化而来。
为鉴定决定OeOSC14底物特异性的关键氨基酸残基，研究者进行了多序列比对和分子对接分析。比对结果显示，OeOSC14的N260位点在多功能三萜合酶中通常为酪氨酸（Y）。将OeOSC14的N260突变为酪氨酸（N260Y）后，该酶从达玛二烯醇特异性合酶转变为多功能三萜合酶，产生β-香树脂醇、α-香树脂醇和达玛烯二醇II等多种产物。相反，将多功能三萜合酶SbχAS的Y259突变为天冬酰胺（Y259N）后，该酶获得了产生达玛二烯醇的能力。分子对接模型显示，第260位残基的空间排列对产物特异性具有决定性影响。
东北刺人参中RK型人参皂苷生物合成受阻的分子机制
尽管东北刺人参叶片积累达玛二烯醇，但未检测到RK型人参皂苷。为解析这一阻断的分子基础，研究者分析了达玛烷型皂苷生物合成中的下游氧化步骤。在人参中，达玛烯二醇II经CYP716A47（C12羟化酶）和CYP716A53v2（C6羟化酶）的依次氧化形成原人参二醇。系统发育分析显示，东北刺人参基因组中含有CYP716A47的直系同源基因（OeCYP），但跨物种共线性分析表明，该基因座在东北刺人参中可能发生了功能缺失。
在烟草中重构RK型人参皂苷的生物合成
为验证RK型人参皂苷的生物合成通路并在植物中实现其从头生产，研究者将OeOSC14与来自人参的CYP716A47、CYP716A53v2以及UGT酶一起在本氏烟草中瞬时共表达。GC–MS分析检测到与达玛烯二醇对应产物的积累（图7A）。进一步共表达UGT后，LC–MS分析在预期保留时间处检测到Rk1、Rk2和Rk3的产物峰（图7B、C），并通过质谱碎裂谱确认了产物身份（图7D）。定量分析显示，Rk1、Rk2和Rk3在烟草叶片中均实现了可检测的积累（图7E）。
讨论与解读
本研究表明，东北刺人参通过OeOSC14这一特化的达玛二烯醇合酶积累RK型人参皂苷的前体骨架达玛二烯醇，但因C12羟化酶功能缺失而无法完成下游氧化步骤，从而不产生RK型皂苷。OeOSC14由一个祖先多功能三萜合酶经复制和新功能化演化而来，单个N260Y氨基酸替换即可逆转其产物特异性，揭示了三萜骨架多样化的分子进化机制。在烟草中重构完整通路实现了Rk1、Rk2、Rk3的从头合成，为这些稀有皂苷的可持续生产提供了植物-based平台。
编译者解读： 该研究巧妙利用了"积累前体但不产终产物"的自然突变体——东北刺人参——作为解析RK型皂苷生物合成通路的理想体系。通过染色体级别基因组、比较基因组学和生化验证的组合策略，不仅鉴定了关键酶OeOSC14，还精确锁定了一个决定产物特异性的单氨基酸位点，展示了合成生物学中"进化-guided"酶工程的应用潜力。在烟草中实现三种RK型皂苷的从头合成，为将来在作物或微生物系统中规模化生产这类高价值稀有皂苷奠定了基础。局限在于当前烟草瞬时表达体系产量有限，后续仍需稳定的异源表达系统优化。
参考来源
Wang X, Zhang H, Kang M, An Z, Song Y. The Oplopanax elatus genome reveals dammaradienol synthase evolution enabling reconstruction of RK type ginsenosides biosynthesis. Nat Commun. PMID: 42342661.
PMID: 42342661