来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
自然界通过酶在微区室中的有序组织实现高效生物合成，但多酶级联在实际应用中常受限于酶不相容性、底物传质差和催化剂回收难等问题。本研究报道了一种在Pickering乳液中运行的活体生物催化平台——通过可调超分子化学将油基光催化剂接枝到过表达酶的工程大肠杆菌表面，形成两亲性“超细菌”，自组装于水-油界面稳定乳液。该平台使化学-酶及多酶级联反应速率较传统双相体系最高提升45倍，支持单步、序贯及一锅法级联反应，并实现了可切换的双模式回收策略。
研究背景
天然生物体内的酶级联系统将简单前体转化为复杂高值分子，其精巧之处在于将多种酶组织于特定细胞微环境中，从而克服底物扩散、竞争反应和催化剂失活等难题。全细胞生物催化利用工程微生物作为自给自足、可自我复制的微型工厂，避免了昂贵的酶纯化步骤，并原位提供必要辅因子，因而备受关注。然而，全细胞催化在涉及疏水性底物或产物的多步级联反应中面临严峻挑战：水相细胞环境与不互溶有机相之间的传质效率低下导致反应速率缓慢；许多级联反应需要生物催化剂与化学催化剂协同作用，而两者的操作条件往往互不兼容；有机溶剂的直接接触还会损害细胞活性。本研究旨在通过活细胞表面的超分子工程，构建一种能在水-油界面稳定运行并高效催化多步反应的活体生物催化平台。
研究方法
材料
商业化学品未经进一步纯化直接使用。大肠杆菌（BL21(DE3)）菌株购自Thermo Fisher Scientific。细胞培养及酶表达方法详见补充信息。
油基催化剂（OBC）的合成
（i）油基催化剂PFA的合成
首先，将棕榈油（88.5 g，0.1 mol）倒入烧瓶中，置于100 °C油浴中脱气1小时。随后，待冷却至60 °C后，通过注射方式加入2-（甲氨基）乙醇（30.4 g，0.4 mol）和甲醇钠（0.6 mL，3 mmol）。反应密封过夜。12小时后，额外加入甲醇钠（0.6 mL，3 mmol），继续反应6小时。粗产物冷却至室温，用二氯甲烷（DCM）稀释。用饱和氯化钠溶液洗涤至有机相澄清。有机相用硫酸镁干燥，旋蒸除去溶剂，得到纯PFA。
（ii）油基催化剂OBC的合成
将PFA（1.5 g，4.4 mmol）、蒽醌-2-羧酸（1.0 g，4 mmol）和4-（二甲氨基）吡啶（DMAP，0.5 g，4.4 mmol）溶解于20 mL DCM中。待完全溶解后，在冰浴中逐滴加入N，N'-二环己基碳二亚胺（DCC，0.9 g，4.4 mmol），反应过夜。产物过滤后，旋蒸除去溶剂，粗产物（有机相）经柱色谱纯化（乙酸乙酯：石油醚 = 1：3）。纯产物（OBC）为淡黄色固体。
胺化环糊精（ACD）的合成
第一步，将β-环糊精（β-CD，25.0 g，22.0 mmol）溶解于250 mL 0.4 M氢氧化钠溶液中，冰浴冷却至5 °C以下。随后，在对溶液剧烈搅拌的条件下，于5分钟内缓慢加入对甲苯磺酰氯（17.5 g，92 mmol）。反应混合物在5 °C下持续搅拌30分钟，然后过滤。所得滤液用浓盐酸中和，继续搅拌1小时。过滤收集所得沉淀，用水充分洗涤（三次），60 °C干燥过夜，得到7.1 g白色固体，即OTs-CD。
第二步，将4，7,10-三氧杂-1，13-十三烷二胺（3.4 g，15.4 mmol）和OTs-CD（4.0 g，3.1 mmol）溶解于10 mL无水N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中，随后加入碘化钾（KI，50 mg，0.3 mmol）。反应混合物在惰性无水气氛下于70 °C搅拌过夜。反应完成后，黄色溶液冷却至室温，用200 mL乙醇稀释。过滤收集沉淀，依次用乙醇和乙醚洗涤，并经柱色谱进一步纯化（乙腈：H₂O：氨水 = 1：1：0.2）。最后，纯化产物在50 °C下真空干燥过夜，得到2.6 g白色固体，即胺化环糊精（ACD）。
缀合物（cell@OBC）的制备
（i）缀合物（cell@CD）的制备
将新鲜收集的大肠杆菌分散于40 mL磷酸钾缓冲液（KPI缓冲液，pH 8.0，0.1 M）中，终OD₆₀₀为2.0。将ACD（10 mM）、EDC（18 mM）和NHS（14 mM）一起加入大肠杆菌分散液中，在4 °C下反应12小时得到粗产物。反应结束后，用KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤三次以除去过量的游离ACD和未反应试剂。离心收集产物，将最终缀合物（cell@CD）悬浮于KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，终OD₆₀₀为2.0备用。
（ii）缀合物（cell@OBC）的制备
将收集的cell@CD分散于40 mL KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，终OD₆₀₀为2.0。随后，将溶解于4 mL DMSO中的OBC（10 mM）加入上述缓冲液中，在4 °C下反应过夜。反应结束后，用含10% DMSO的KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤三次以除去过量游离OBC。离心收集产物（cell@OBC）。
不同大肠杆菌的界面催化
将0.6 mL过表达不同酶的cell@OBC溶液与0.4 mL有机溶液混合，通过手摇制备乳液。随后，在乳液中加入100 mM底物引发反应。在每个时间间隔，取20 μL混合物，用180 μL乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥。离心后，取150 μL上清液进行气相色谱测量。所有实验均设三次重复。
报告摘要
研究设计的进一步信息详见本文附带的Nature Portfolio报告摘要。
研究结果
活体两亲性生物催化剂的设计与合成
本策略始于关键组分的模块化合成：胺化β-环糊精（ACD）宿主和定制的OBC客体（补充图1）。两种分子的成功合成及纯度经¹H NMR、TLC-MS和FTIR光谱严格确认（补充图2、3、4和5）。获得这些结构单元后，我们对活体大肠杆菌BL21（DE3）细胞表面进行了工程化改造。“超细菌”颗粒的构建是在温和、生物相容条件下执行的两步过程。首先，通过偶联剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将ACD宿主共价接枝到细胞表面，得到cell@CD缀合物（补充图6）。其次，引入OBC客体，通过环糊精空腔内的主客体包合作用自发组装到细胞表面，形成最终的cell@OBC颗粒。OBC的成功非共价附着经UV-Vis光谱证实——cell@OBC在330 nm处呈现蒽醌部分的特征吸收，而天然细胞与游离OBC的对照混合物中不存在该峰（补充图7）。这一结果为稳定的超分子连接提供了明确证据。关键的是，我们验证了蒽醌单元的光催化活性未因其缀合到OBC结构中而受到阻碍，为后续研究提供了极佳的起点（补充图8）。
为可视化表面修饰并优化其密度，我们使用金刚烷标记的荧光素染料（AM-FITC）对cell@CD缀合物进行荧光标记，该染料特异性结合表面接枝的环糊精空腔（图2a）。设计的一个核心原则是在保持细胞活力和功能的同时调控表面化学。通过改变偶联试剂（EDC/NHS）的浓度，可精确控制细胞表面β-CD的密度，以相应的荧光强度增加进行定量（图2b）。同时，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示cell@CD缀合物周围呈现明显的绿色荧光，而天然细胞或仅与染料混合的对照细胞无此现象，证实了β-CD宿主的成功共价附着（图2c）。此外，修饰细胞与天然细胞之间的失重差异单调增加，揭示了表面接枝的可调性（图2d和补充图9）。随后，通过ζ-电位表征表面电荷，显示随着超分子负载量的增加，电位从天然细胞的−45 mV逐渐变为−6 mV（图2e和补充图10）。这些发现表明，细胞表面的超分子层可被精确调控以适应多样化的功能需求。
然而，这种功能化揭示了表面修饰程度与胞内酶活性保留之间的反比关系。我们使用过表达苯甲醛裂解酶（BAL）的大肠杆菌评估了对胞内酶功能的影响，发现过度的表面功能化虽然增加了疏水性，却显著降低了酶的保留活性（图2f）。这一下降可能归因于致密表面层造成的传质限制或潜在的化学胁迫。相反，功能化不足则无法提供稳定乳液所需的两亲性（图2f，插图）。通过系统优化，我们确定18 mM EDC和14 mM NHS的偶联条件达到了最佳平衡，在保持超过97%胞内酶活性的同时赋予稳健的乳化性能。为进一步确认超分子层附着于细胞表面不会引入额外的传质屏障，我们裂解cell@OBC释放游离BAL酶，并将其活性与cell@OBC和天然细胞进行比较。结果显示三者之间几乎无差异（图2g和补充图11），有力支持了我们的假设，为后续研究奠定了坚实基础。
增强的细胞稳健性与生物相容性
全细胞催化的一个关键优势在于细胞为酶提供的保护性环境。我们假设表面修饰可进一步保护细胞免受过程中常见严苛条件的损害。为验证这一点，我们对cell@OBC缀合物施加热和化学胁迫。当暴露于45 °C两小时时，cell@OBC保留了其初始胞内BAL活性的69.6%，较未修饰的天然细胞提高了2.4倍（图3a）。更引人注目的是，当面对甲苯-水界面这一以诱导细胞裂解著称的条件时，cell@OBC缀合物在两小时后仍保持52.2%的活性，而天然细胞的活性显著下降，稳定性提高了2.8倍（图3b）。还测试了N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、异丙醇和二甲基亚砜（DMSO）等其他溶剂，以进一步巩固聚合物对有机溶剂的保护作用（补充图12）。此外，经过2小时紫外线照射后，cell@OBC的保留活性仍比天然细胞高2.1倍（图3c和补充图13）。这些发现通过活/死染色实验得到进一步证实——在热和有机溶剂胁迫下，cell@OBC缀合物的存活率均优于天然细胞（图3d-i）。
Pickering乳液的构建与表征
我们进一步考察了偶联剂浓度对乳液性能的影响。随着偶联剂浓度的增加，细胞表面疏水性增强，乳液液滴尺寸逐渐减小且形态更加均一（图4a）。在甲苯-水双相体系中，天然细胞因界面应力而破裂失活，而cell@OBC则能稳定地锚定于油水界面，形成稳定的Pickering乳液（图4b）。cell@OBC对多种有机溶剂均表现出优异的耐受性，能与正己烷、甲苯、乙酸乙酯等广泛溶剂形成稳定乳液（图4c）。乳液在0小时和24小时的外观对比显示，cell@OBC稳定的乳液在24小时后仍保持良好的乳化状态，无明显破乳现象（图4d-e）。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和光学显微镜图像证实了水包油型乳液的形成，水相被绿色荧光标记（图4f-g）。乳液稳定性指数（CI）随时间的变化表明，经过48小时储存后乳液趋于最终稳定状态（图4h）。三维CLSM图像及放大细节进一步揭示了cell@OBC在油水界面的分布情况（图4i-j）。为验证细胞在界面上的存活状态，我们使用过表达绿色荧光蛋白（GFP）的cell@OBC稳定乳液，二维和三维CLSM图像均显示GFP荧光信号集中于界面区域，证明细胞以活体状态锚定于油水界面（图4k-l）。界面处GFP蛋白的荧光强度进一步证实了乳液粒径的均一性（图4m）。当水油比为6：4时，cell@OBC稳定的乳液液滴数量及尺寸分布显示液滴尺寸主要集中在20-40 μm范围内（图4n）。在不同水相比例（10%-80%）下，乳液液滴的界面面积随水相比例的增加而增大（图4o）。
界面生物催化性能
我们首先通过荧光显微镜直观展示了cell@OBC稳定的界面生物催化过程（图5a）。在不同水油比条件下，BAL酶活性表现出显著差异——水油比为6：4时酶活性最高，表明该比例下界面面积与传质效率达到最优平衡（图5b）。为验证该平台的普适性，我们测试了OBC作为光催化剂将苯甲醇转化为苯甲醛的反应，结果显示乳液体系中的转化率显著高于传统双相对照体系（图5c）。此外，Cal B催化的水解反应（图5d）和酯化反应（图5e）均在该乳液体系中高效进行，证明了酶促反应类型的多样性。为进一步拓展平台的应用范围，我们在活细胞内分别过表达转氨酶（ATA）、R型醇脱氢酶（RR ADH）和BAL，三种不同的酶促反应均在乳液体系中成功实现（图5f-h）。
级联催化：从单步到多酶装配线
受天然代谢途径中多酶有序组织的启发，我们设计了可定制的级联催化装配线，以实现从简单底物到高附加值化学品的转化（图6a）。首先，以ATA和RR ADH的组合探索双酶级联反应（图6b），两种酶在乳液中的协同催化效率显著高于双相体系。随后，通过ADH ht与BAL的组合验证了可扩展的多酶级联催化方案（图6c）。Cal B与cell@OBC表面的光响应单元结合，开启了光酶级联催化的可能性（图6d）。更进一步，我们构建了基于ATA、LK ADH和Cal B的三步序贯级联催化体系（图6e）。序贯级联中第一步和第二步的催化效率测试显示，反应后乳液体系仍保持稳定（图6f，插图）。最后，我们实现了OBC、Cal B和BAL介导的一锅法级联催化（图6g）。一锅法级联反应的催化效率随时间变化曲线显示反应在约48小时内达到平衡，反应后乳液体系的CLSM图像证实了乳液结构的完整性（图6h，插图）。为验证平台的放大可行性，我们制备了5 L放大乳液并进行催化反应（图6i），最终获得约7.5 g纯化安息香产物（图6j）。
按需双模式回收策略
为满足可持续催化的需求，我们设计了基于动态超分子连接的全细胞回收方案（图7a）。回收前Pickering乳液的CLSM液滴形态（左侧上方）与回收后cell@OBC形成的新乳液（右侧上方）显示，回收后的细胞仍能有效稳定乳液；过表达GFP蛋白的cell@OBC在回收前后均稳定于界面（图7b，下方）。经过5次回收循环后，cell@OBC在单步和级联催化中仍保持高催化活性（图7c）。不同回收次数后cell@OBC的相对菌落数及铺板实验显示，经过多次回收后细胞存活率略有下降但仍保持较高水平（图7d）。天然细胞（灰色）、新鲜cell@OBC（绿色）和回收cell@OBC（黄色）的生长曲线对比表明，回收过程对细胞增殖能力的影响有限（图7e）。冷冻透射电镜（cryo-TEM）图像显示，新鲜cell@OBC（图7f）和回收cell@OBC（图7g）均保持完整的细胞结构，放大细节进一步确认了细胞形态的完整性。此外，我们还展示了从Pickering乳液体系中回收光催化剂的方案示意图（图7h）。分子动力学模拟用于评估宿主与多个客体分子之间的相互作用和键合过程（图7i），两个客体与宿主分子之间的径向分布函数（图7j）以及两种不同主客体相互作用体系的平均能量（图7k）从分子层面揭示了超分子连接的可逆性和稳定性。回收前乳液的CLSM图像与OBC结合新鲜细胞形成的新乳液的CLSM图像（图7l，上方），以及两者的三维CLSM图像进一步证实了回收策略的可行性。最后，回收后形成的新乳液成功完成了四次单步催化反应和一次级联催化反应（图7m），充分彰显了该催化策略的可持续性。
讨论与解读
本研究通过超分子表面化学策略，成功将油基光催化剂以非共价方式锚定于活体大肠杆菌表面，构建了具有Pickering乳液稳定能力的“超细菌”平台。该平台的核心创新在于：利用环糊精-客体主客体相互作用实现可逆的表面修饰，既保证了催化功能，又允许按需解离回收。实验数据表明，该策略使细胞在45 °C热胁迫下活性保留提高2.4倍，在甲苯-水界面应力下稳定性提高2.8倍，且反应速率较传统双相体系最高提升45倍。级联催化实验验证了平台支持单步、序贯和一锅法等多种反应模式，5 L放大实验获得约7.5 g安息香产物，展示了良好的工业应用前景。
编译者解读
该研究体现了合成生物学中“界面工程”与“模块化设计”的深度融合。通过超分子化学实现活细胞表面的可逆功能化，既保留了全细胞催化的自修复和辅因子再生优势，又赋予细胞界面催化和光催化能力，这种“活体组装”策略在绿色生物制造中具有重要价值。值得关注的是，双模式回收设计通过动态共价键的可逆断裂与重建，实现了生物催化剂和化学催化剂的分流回收，显著提升了原子经济性。然而，该平台目前仍依赖手摇乳化方式，工业化规模下的连续乳化工艺和长期运行稳定性尚需进一步验证。此外，宿主-客体相互作用的体内稳定性及复杂工业环境中的耐受性也是后续产业化需要重点关注的问题。
参考来源
Wu X, Dimde M, Karring H, Wang Z, Wu C. Assembly-Line Biosynthesis in Living-Cell Emulsions via Tunable Supramolecular Surface Chemistry. Nat Commun. PMID: 42342679.
PMID: 42342679