来源：STAR Protoc | 编译：DNA Lab Space
导语：酿酒酵母的CRISPR-Cas9基因编辑长期受制于sgRNA表达质粒的繁琐构建。2025年发表于《STAR Protocols》的一项工作提出，用PCR产物直接完成guide序列插入，跳过限制性酶切与连接步骤，使guide迭代周期大幅缩短。该方法以KanMX/G418筛选标记贯穿质粒构建与酵母转化，并通过LiAc/PEG共转化同时导入sgRNA质粒和修复供体，在2–3天内即可获得编辑菌落。
研究背景
CRISPR-Cas9系统在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的应用早已不局限于基因敲除——点突变引入、片段删除、标签整合和启动子替换都依赖这一工具。但系统的工作流程中，最耗时的环节往往不是编辑本身，而是向导RNA（sgRNA）表达质粒的构建。传统做法需要用限制性内切酶切开质粒骨架，再通过连接酶把退火后的寡核苷酸插入guide序列，这一步骤不仅依赖特定酶切位点的可用性，还需要每次设计新的寡核苷酸并重复相同的克隆流程。当研究者需要同时测试多个guide位点或对多个基因进行编辑时，酶切-连接的克隆策略就变得低效且昂贵。
这篇论文提出了一种基于PCR的guide插入方案——利用PCR扩增产物直接替换原有的guide序列，同时实现质粒的环化。它绕开了限制酶和连接酶，让guide构建变为一个PCR反应加上大肠杆菌转化。作者将这一流程整合进完整的基因组编辑工作流：从sgRNA和HDR供体的设计，到质粒在大肠杆菌中的克隆与测序验证，再到利用LiAc/PEG方法将验证后的质粒与供体共同转入酵母。整个流程的设计目标是简化guide构建并支持快速迭代。
研究方法
该protocol覆盖的工作流可分四个阶段：sgRNA与供体设计、PCR介导的guide插入与质粒扩增、大肠杆菌中的克隆验证、以及酵母的共转化与筛选。原文对各阶段的试剂配方和操作步骤有详细交代。
培养基与试剂配制
论文首先给出了LB液体培养基的规格：LB肉汤粉25 g/L，加入去离子水定容至1 L，121°C高压灭菌20–30分钟。待冷却至约55°C后，加入过滤除菌的卡那霉素贮存液（50 mg/mL）至终浓度50 μg/mL，轻轻混匀。不含抗生素的LB液体培养基可在室温保存至多6个月，含卡那霉素的培养基则需4°C保存并限1个月内使用。
LB卡那霉素琼脂平板的配方在液体培养基基础上增加Bacto琼脂1.5%（w/v，即每升15 g）。灭菌时间要求至少20分钟，冷却至约55°C后加入卡那霉素，缓慢旋转混匀以避免产生气泡，随后倒入无菌培养皿。凝固后倒置，装入标记好的封口袋，4°C下最多保存1个月。
酵母培养方面，YPD液体培养基含葡萄糖2%（w/v，10 g）、蛋白胨2%（w/v，10 g）、酵母提取物1%（w/v，5 g），加ddH2O定容至500 mL，121°C高压灭菌15–20分钟。灭菌后的YPD液体培养基可在室温保存不超过6个月。
YPD-G418琼脂平板的配制则在液体配方基础上加入Bacto琼脂2%（w/v，10 g），同样定容至500 mL后灭菌。冷却至约55°C时加入G418贮存液（50 mg/mL）至终浓度500 μg/mL（即5 mL），混匀倒板。原文未详述该平板的保质期。
sgRNA与HDR供体设计
对于单链向导RNA（sgRNA），论文说明了设计逻辑：guide序列需定位到目标位点并满足Cas9的PAM要求。编辑完成后，供体设计中应包含静默突变以破坏PAM序列，从而防止Cas9在修复后再次切割。同源定向修复（HDR）供体则需要设计同源臂，其两端序列与切割位点两侧的基因组序列对应，用于引导修复。原文摘要未详述同源臂的推荐长度或供体的具体形式（单链寡核苷酸或双链PCR片段），但这些参数在论文全文中有进一步说明。
PCR介导的guide插入与质粒环化
此步骤是本protocol的核心创新。作者使用PCR扩增的方式将sgRNA序列直接安装到Cas9-sgRNA质粒骨架上，同时实现质粒的无缝环化——即PCR产物两端包含质粒上guide插入位点两侧的同源序列，转化大肠杆菌后利用细胞内同源重组完成环化。原文摘要明确指出，这一过程替代了传统的限制酶/连接酶克隆，实现"无缝"（seamless）的质粒重新环化。
大肠杆菌中的克隆与序列验证
PCR产物转化大肠杆菌后，含卡那霉素的LB平板用于筛选携带KanMX标记质粒的克隆。随后提取质粒并进行序列测定，以确认guide序列正确插入且无突变。原文未提供转化用量（如PCR产物的微克数）、感受态细胞类型或热激参数。但明确强调了序列验证是进入酵母转化前的必要步骤——只有经过测序确认的质粒才能用于后续实验。
酵母LiAc/PEG共转化
将测序验证过的Cas9-sgRNA质粒与HDR供体共同转入酵母。转化方法采用醋酸锂/聚乙二醇（LiAc/PEG）法。质粒携带KanMX标记，因此转化后的酵母可在含G418的YPD平板上进行筛选。原文未给出LiAc浓度、PEG分子量与用量、热激温度与时间、以及供体DNA的具体用量。
转化后的酵母在非选择性培养基中短暂恢复，随后涂布于YPD + G418平板，30°C培养2–3天。携带质粒的菌落会正常生长，而未携带质粒的细胞则被G418杀死。
研究结果
论文在"预期结果"部分系统描述了该工作流各阶段应出现的现象与数据。这些结果既是判断实验是否成功的标准，也反映了该方法在真实应用中的表现。
转化与编辑效率的间接判断：菌落数量对比
LiAc/PEG转化和恢复培养后，G418筛选富集了携带KanMX标记CRISPR质粒的酵母细胞。30°C培养2–3天后，"CRISPR + HDR donor"条件通常产生大量菌落，而"无修复（–HDR donor）"对照只产生少量菌落。论文解释了这个"多对少"的对比——Cas9切割对细胞是致死性的，如果没有修复模板，DNA双链断裂无法被修复，细胞便不能存活。因此，这一对比同时说明了两个问题：第一，转化和筛选流程正常运转；第二，所选guide序列能在目标位点有效引导Cas9切割。这个定性的"多"与"少"的对照，是进入下游筛选前的重要质量关卡。
编辑克隆的分子验证：菌落PCR与测序
在获取转化子后，作者建议筛选6–8个菌落进行菌落PCR，所用引物设计在同源臂外侧。正确编辑的克隆应产生预期大小的扩增产物。对于删除或插入类型的编辑，PCR产物相对于未编辑对照会显示条带位移；而点突变则需要通过DNA测序最终确认。论文特别强调了测序的必要性——跨越编辑连接区域的DNA测序应确认设计基因型的正确性，包括供体中所含的静默PAM破坏突变。成功实验中，至少有一部分被筛选的菌落经PCR验证为编辑阳性。
质粒丢失与无痕编辑
编辑确认后，作者还描述了去除CRISPR质粒的步骤。将编辑后的克隆在非选择性培养基（YPD）上培养传代，一部分细胞会自然丢失KanMX标记的CRISPR质粒。通过影印接种到YPD和YPD + G418两种平板即可评估质粒丢失情况——被治愈的克隆能在YPD上生长，但在G418平板上不能生长。这一操作的重要性在于，它让最终获得的酵母菌株不携带外源质粒，仅保留基因组上的目标编辑，从而避免持续的Cas9切割活性可能带来的脱靶风险。
方法在不同编辑类型中的适用性
从结果部分的描述来看，该protocol在设计上覆盖了多种基因编辑场景：删除（deletions）、插入（insertions）和点突变（point mutations）均可通过调整HDR供体来实现。删除和插入通过菌落PCR的条带位移即可初步判断，而点突变则必须借助DNA测序。PAM破坏突变的引入是设计HDR供体时的关键细节——无论编辑类型如何，这条规则都适用，目的是防止编辑完成后Cas9对修复好的位点再次切割。
讨论与展望
这个protocol最直接的贡献在于把guide构建从"酶切-连接-转化"的三步流程压缩为"PCR-转化"两步，而这正好是整个CRISPR编辑流程中制约通量的瓶颈。当研究者需要对一个基因的不同区域设计多个guide、或同时编辑多个基因时，这种简化带来的时间节省是实打实的。
从方法学上看，PCR介导的guide插入与质粒环化利用了酵母和大肠杆菌自身的同源重组机制——这种策略并不需要额外的酶处理，也避免了酶切位点兼容性的限制。与传统的Golden Gate或限制酶克隆相比，它对guide序列本身几乎没有序列偏好的要求。此外，KanMX/G418筛选标记在质粒构建和酵母筛选两个阶段通用，减少了筛选标记转换的步骤。
可以预见，这套流程在多基因编辑、饱和诱变、启动子工程等需要大规模并行构建guide的场景中尤为适用。后续若能将guide设计和供体设计流程软件化，配合自动化PCR工作站，整个编辑流程的吞吐量还有进一步上升空间。原文提供了关键的实验参数，但对大肠杆菌转化条件、酵母转化体系的DNA用量等环节的细节未逐一列出——研究者在实际操作时可能仍需结合实验室既有条件进行优化。
参考来源
期刊：STAR Protocols
标识：PMID: 42519825
PMID: 42519825