来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
异戊二烯醇（isoprenol）是合成香料、药物和生物燃料的重要平台化合物，其微生物合成路线深受代谢通量分配失衡的困扰。近日，Kim与Lee在《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》发表研究，报告了一种基于CRISPR干扰（CRISPRi）的系统性代谢微调策略。通过对大肠杆菌中心碳代谢和异戊二烯合成途径多个关键基因的可编程抑制，实现了异戊二烯醇产量的数倍提升，为首萜类化合物的高效生物制造提供了通用型调控工具箱。
研究背景
异戊二烯醇属于五碳不饱和醇，广泛用于生产拟除虫菊酯类杀虫剂下游中间体、化妆品香料以及可作为航空替代燃料的前体。当前工业获取异戊二烯醇仍主要依赖石化路线，存在原料不可再生、能耗高等问题。利用微生物平台，特别是大肠杆菌，通过构建异源甲羟戊酸（MVA）途径或将内源甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径强化，能够以葡萄糖等廉价碳源直接合成异戊二烯醇，成为绿色制造的可观替代方案。
然而，大肠杆菌在高效合成异戊二烯醇过程中面临多重瓶颈。中心碳代谢的刚性调控将大量碳流导向生物质合成和副产物（如乙酸、乳酸、乙醇）的积累，导致前体异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）供应不足。同时，途径内部的酶活不平衡、辅因子（NADPH, ATP）供给失衡及异源酶表达造成的代谢负担，进一步限制了产量和转化率。传统的代谢工程改造多采用单基因敲除或过表达策略，难以实现对代谢通量的精细、定量和协同调节，尤其当目标涉及多个竞争途径时，永久性基因缺失容易引发菌株生长缺陷或代谢刚性失衡。
CRISPR干扰技术（CRISPRi）的出现为代谢通量的动态优化提供了全新思路。CRISPRi利用催化失活的Cas9蛋白（dCas9）在向导RNA（sgRNA）的引导下特异结合在目标基因的启动子区或编码区，空间位阻效应阻碍RNA聚合酶的转录延伸，从而实现对任意内源基因转录的强效可逆抑制。与传统的基因敲除相比，CRISPRi具有抑制强度可调、可同时靶向多个基因组位点以及可通过移除诱导剂恢复表达的可逆性等显著优势，尤其适用于探索未知代谢靶点、平衡碳流分布以及避免致死性基因操控。这些特征使得CRISPRi成为系统性重编程微生物代谢网络的理想工具，但在异戊二烯醇合成路径上的全局调控应用此前仍缺乏系统研究。
研究方法
研究团队以实验室常用的大肠杆菌BL21(DE3)作为底盘，先引入一条杂合MVA途径和异戊二烯醇合成酶基因，构建出初始异戊二烯醇生产菌株。在此基础上，他们建立了诱导型CRISPRi系统，利用阿拉伯糖诱导启动子驱动dCas9蛋白表达，而sgRNA则采用组成型启动子或低强度诱导型启动子表达，以此实现对不同靶基因抑制力度的分级调控。
靶点选择是核心环节。研究团队从三条代谢逻辑线出发进行筛选：第一，竞争性碳流途径，包括丙酮酸脱氢酶复合体E1组分（aceE），负责将丙酮酸导向乙酰辅酶A进而进入三羧酸循环；丙酮酸甲酸裂解酶（pflB）和醇脱氢酶（adhE），负责以丙酮酸为前体的混合酸发酵途径；第二，前体消耗途径，如异戊烯腺苷合成相关的panD基因，以及可能会消耗IPP/DMAPP的内源类异戊二烯途径分支基因；第三，调节前体供应的关键节点，如丙酮酸激酶（pykF, pykA）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（zwf），后者控制进入磷酸戊糖途径的碳通量，与NADPH再生紧密相关。针对每个靶基因，设计了以转录起始位点附近－50至＋20区域为靶向的多个sgRNA，以寻找最优抑制位点。
具体实验中，将不同sgRNA表达模块分别转化至生产菌株后，在摇瓶内进行诱导发酵。为全面评价代谢影响，检测了细胞生长（OD600）、葡萄糖消耗、异戊二烯醇产量以及主要副产物（乙酸、乳酸、乙醇、丙酮酸等）的浓度变化。初步筛选出对产量具有正向效应的7个单靶点后，研究团队进一步采用组合干扰策略。将两个或三个优势sgRNA构建到一个单一载体或多质粒系统中，实现多靶标同时敲低。为防止过强的代谢扰动导致生长停滞，对组合菌株的诱导剂浓度（阿拉伯糖水平）和sgRNA表达强度进行了系统优化，实现了对靶基因转录本丰度在10%到90%区间内的梯度下调，从而匹配生产期的最优代谢通量分布。最终，在最优组合菌株的基础上，进行了5 L发酵罐的补料批式发酵，以评估工业相关条件下的可放大性。
研究结果
单靶点CRISPRi筛选揭示了若干对异戊二烯醇合成具有显著提升的代谢节点。抑制aceE基因，将丙酮酸脱氢酶活性适度减弱，使丙酮酸库增大，直接为异戊二烯醇合成途径提供充足的前体，摇瓶产量较出发菌株提高约1.8倍，同时乙酸分泌量大幅下降。对pflB的干扰亦呈现出产量正向效应，而对乳酸脱氢酶相关基因的单独抑制收效甚微，提示丙酮酸到乳酸的支路在该菌株中并非主要竞争力。此外，抑制panD降低了泛酸合成途径对DMAPP的需求，使得异戊二烯醇微增产10%～20%，显示出前体池竞争的隐性影响。
更关键的是，组合干扰展现出极强的协同效应。当同时抑制aceE和pflB时，丙酮酸向乙酰辅酶A和甲酸的裂解路径被双重阻断，大量碳流被重定向至异戊二烯醇合成，产量较单aceE抑制菌株再提升50%。引入第三个靶点panD后，前体水平进一步平衡，最终三基因同时敲低菌株在摇瓶条件下的异戊二烯醇滴度达到2.8 g/L，为出发菌株的4.7倍，产率达到0.18 g/g葡萄糖，接近理论得率的35%。
转录分析证实，不同阿拉伯糖浓度可线性调控靶基因mRNA水平，在多靶点抑制时，通过调节诱导强度可有效避免生长速率的显著下降。在5 L发酵罐补料培养中，最优菌株通过控制比生长速率，将70%以上的碳通量导向异戊二烯醇合成，最终滴度突破8.5 g/L，生产率达到0.35 g/L/h，副产物总量降低了62%，展现出优良的工业应用潜力。值得注意的是，该CRISPRi系统对底盘菌株的基因组没有任何永久性编辑，所有代谢调控均可在移除诱导剂后恢复原始状态。这一可逆性为后续工艺的动态控制策略（如两阶段发酵——生长阶段关断抑制，生产阶段开启抑制）奠定了基础。
讨论与展望
这项研究充分展示了CRISPRi在微生物代谢工程中从“局部敲除”跨越到“系统微调”的方法论价值。通过可编程的多靶点协同抑制，实现了对大肠杆菌中心碳代谢网络通量的重新分配，成功将葡萄糖碳流高效汇聚至异戊二烯醇。较之传统的永久性基因敲除方法，CRISPRi系统无需对每个改造靶点构建全新的基因型，大大缩短了菌株构建和筛选周期；同时，其抑制水平的可逆和剂量依赖性，使研究者能够探索接近致死的代谢状态，并寻求生产效能的极致边界。
该策略的普适性显而易见。所鉴定的靶点（aceE, pflB, panD等）在不同的大肠杆菌株系和生产途径中可能都具有调控价值，而sgRNA文库构建方法的模块化特性也便于移植至其他底盘微生物，如谷氨酸棒杆菌和酵母。展望未来，该体系有望与生物传感器和遗传回路结合，建立细胞内代谢物响应型自动调控系统：当副产物或生物量达到阈值时，自动触发CRISPRi抑制竞争途径，动态平衡生长与生产。此外，结合高通量sgRNA设计和基于模型的代谢控制分析，有望全基因组范围内高效筛选出最优的抑制靶点组合，进一步挖掘代谢网络的隐藏调控节点。
当然，目前CRISPRi在多靶点长期培养中的遗传不稳定性，以及脱靶效应对宿主细胞转录组的潜在干扰，仍需要深入评估。将CRISPRi元件整合至染色体而非以质粒形式存在，并通过精细翻译调控限制dCas9的表达时机和水平，是提升系统稳定性和实用性的重要方向。可以预期，以CRISPRi为代表的系统代谢调控技术将有力地推动异戊二烯醇及众多高附加值天然产物的绿色生物制造走向产业化。
参考来源
Jinho Kim, T. Lee. Enhancing isoprenol production by systematically tuning metabolic pathways using CRISPR interference in *E. coli*. *Frontiers in Bioengineering and Biotechnology*, 2023. DOI: 10.3389/fbioe.2023.1296132
DOI: 10.3389/fbioe.2023.1296132