来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）是人乳中含量最丰富的一种岩藻糖基化寡糖，对婴幼儿肠道健康与免疫发育至关重要，已成为高端婴儿配方奶粉的核心功能因子。然而，受限于传统供体底物依赖和胞内前体供给不足，微生物合成2′-FL的工业潜力始终未得到充分释放。近期，Li等研究人员以大肠杆菌为底盘，通过多模块代谢工程策略重塑从头合成途径，系统性破解了限速步骤，实现了2′-FL的高效积累。该研究不仅将产量推至新高度，更构建了一个可推广的理性设计范式，为功能寡糖的生物制造开辟了清晰的技术路径。
研究背景
2′-岩藻糖基乳糖（2′-fucosyllactose, 2′-FL）是由L-岩藻糖通过α-1,2-糖苷键连接至乳糖还原端的半乳糖残基上形成的三糖。作为首批获准商业化添加至婴儿配方食品的人乳寡糖（HMOs），2′-FL能够选择性促进双歧杆菌等有益菌的增殖，抑制病原体定植，并直接参与免疫调节，显著降低婴幼儿腹泻和呼吸道感染风险。全球2′-FL市场规模已突破2亿美元，并持续高速增长，促使科研界和产业界不断追寻更经济、更绿色的合成路线。
微生物合成2′-FL主要依赖两种策略：全细胞生物转化和从头合成。全细胞生物转化需外源添加昂贵且不稳定的L-岩藻糖作为前体，经济性偏低。从头合成途径则利用葡萄糖或甘油等廉价碳源，通过胞内GDP-L-岩藻糖途径和乳糖供给原位生成2′-FL，被认为更具工业放大前景。该途径的核心模块包括：GDP-L-岩藻糖合成模块（经由甘露糖-6-磷酸→甘露糖-1-磷酸→GDP-甘露糖→GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖→GDP-L-岩藻糖）、乳糖摄取模块（乳糖通透酶LacY）以及岩藻糖基转移模块（α-1,2-岩藻糖基转移酶FucT2）。然而，野生型大肠杆菌中GDP-L-岩藻糖节点代谢通量极弱，且存在强烈的旁路竞争（如合成可拉酸）和产物降解（β-半乳糖苷酶LacZ水解乳糖与2′-FL）。早期研究多集中于单基因过表达或敲除，虽取得一定进展，但因胞内辅因子不平衡、代谢刚性瓶颈及毒性中间体积累等问题，产物滴度长期徘徊在个位数克每升级别。如何全局协调碳源代谢、能量供给与氧化还原平衡，系统性重塑从头合成途径，成为突破困局的关键。
研究方法
研究者以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株，采用“设计-构建-测试-学习”循环，分四大模块对从头合成途径进行迭代优化。
**1. 底盘细胞预处理：阻断竞争与降解途径**
为消除可拉酸合成对GDP-L-岩藻糖前体的争夺，首先敲除了编码尿苷二磷酸葡萄糖脂质载体转移酶的*wcaJ*基因，彻底阻断可拉酸外排通路。同时，为防范产物2′-FL被β-半乳糖苷酶水解，失活了*lacZ*基因。为避免质粒系统带来的代谢负担和抗生素依赖，后续关键途径基因均采用基因组整合策略，通过CRISPR-Cas9辅助的同源重组技术逐一定点插入高拷贝整合位点。
**2. GDP-L-岩藻糖合成模块强化**
该模块包含磷酸甘露糖变位酶（ManB）、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶（ManC）、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶（Gmd）和GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶/还原酶（WcaG）。研究者首先将来源大肠杆菌K-12的*manB*、*manC*、*gmd*、*wcaG*以操纵子形式组合，并在基因组中高表达。进一步，通过调节核糖体结合位点（RBS）强度，精细调控ManC与ManB的表达比例，发现将*manC*翻译起始率调至*manB*的约2.5倍时，能有效拉动甘露糖-6-磷酸向GDP-甘露糖的通量，减少糖酵解分流。针对限速酶Gmd，采用定向进化与饱和突变，获得了热稳定性和催化效率双提升的突变体Gmd(Asn182Asp)，使中间体GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖的积累下降70%以上。
**3. 增强前体供应与辅因子再生**
为确保甘露糖-6-磷酸库充盈，研究过表达了磷酸甘露糖异构酶（ManA）的编码基因，并删除了竞争葡萄糖-6-磷酸的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因*zwf*，迫使碳流更多转向果糖-6-磷酸→甘露糖-6-磷酸。为解决WcaG催化步骤对NADPH的强烈依赖，团队引入了来源于枯草芽孢杆菌的NADP+依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GapN），该酶不可逆地将甘油醛-3-磷酸转化为3-磷酸甘油酸并直接生成NADPH，绕过了糖酵解原有NAD+依赖步骤，实现了NADPH原位再生与氧化还原自平衡。同时，协同强化了戊糖磷酸途径的转酮醇酶（TktA）和转醛醇酶（TalB），使NADPH供给能力显著增强。
**4. 乳糖转运与岩藻糖基转移优化**
乳糖摄取是产物合成的直接入口。研究者对比了不同来源的乳糖通透酶，最终保留大肠杆菌自身LacY并启动子替换为强组成型启动子P*trc*，以消除乳糖诱导的延迟，并提高转运速率。岩藻糖基转移酶选用了幽门螺杆菌来源的FucT2，其具有良好的可溶性和底物专一性。为降低GDP-L-岩藻糖胞内水解及产物反馈抑制，通过N端融合SUMO标签促进FucT2的正确折叠与可溶性表达，并在发酵过程中优化乳糖流加速率，维持胞内乳糖浓度处于低催泪防止转运饱和但足够推动糖基化反应的区间。
摇瓶条件优化后，最终在5 L发酵罐中进行分批补料发酵验证，通过溶氧反馈控制葡萄糖和乳糖的流加，维持比生长速率与产物合成阶段的代谢静息状态。
研究结果
经过多轮迭代，菌株的2′-FL合成性能获得了飞跃式提升。
在摇瓶培养中，原始菌株几乎检测不到2′-FL。单独阻断*wcaJ*和*lacZ*的菌株仅生成微量产物（<0.1 g/L）。模块化整合GDP-L-岩藻糖途径后，2′-FL产量增至1.2 g/L，证明合成模块成功建立。在此基础上精细调控ManC/RBS比例，产量进一步跃升至2.4 g/L，提升了近一倍。引入Gmd突变体Gmd(N182D)使最大比生产速率提高约35%，摇瓶产量达到3.1 g/L，同时中间体浓度大幅衰减，表明脱水酶步骤的代谢流畅性得到根本改善。
前体供给与辅因子工程的叠加效应尤为显著。强化ManA并敲除*zwf*后，胞内甘露糖-6-磷酸浓度提升了4.2倍，2′-FL产量增至4.6 g/L。引入GapN构建的NADPH再生回路使得产量飙升到6.3 g/L，NADPH/NADP+比值由0.8攀升至1.9，随后TktA和TalB的协同过表达将这一比值推至2.2，摇瓶产量最终达7.0 g/L，较出发菌株提高了数百倍。发酵尾液分析显示，乙酸等小分子有机酸积累较对照降低了60%，提示代谢流被有效导向产物合成而非溢流代谢。
在5 L发酵罐放大实验中，采用D-stat控制策略，葡萄糖限制性流加以维持低生长速率，乳糖则以恒定速率与脉冲补加相结合，发酵54小时后2′-FL终浓度达到58.3 g/L，生产强度为1.08 g/L/h，底物乳糖的克分子转化率达到0.82 mol/mol，接近理论最大值。值得强调的是，该结果从未外源添加L-岩藻糖，完全依靠从头合成途径，实现了当时公开报道中的最高滴度之一。代谢物组学分析确认，终期胞内GDP-L-岩藻糖库维持在0.12 μmol/g DCW的低水平，表明其向产物的高效抽提；路径中间产物浓度整体呈下降趋势，无异构副产物检出。菌株在连续传代50代后产量保持稳定，整合模块未出现丢失，显示出良好的遗传稳定性。
讨论与展望
这项工作通过分层级、多靶点的代谢工程改造，成功将大肠杆菌从几乎不生产2′-FL的状态重塑为高产细胞工厂，揭示了该系统在辅因子平衡和代谢弹性方面的深层局限与破解之道。与既往依赖质粒过表达或单节点强化的研究不同，该策略强调基因组整合下的表达强度精细配平、NADPH池的动态平衡以及乳糖转运窗口的精确控制，从“局部最优”走向“系统最优”，为类似糖基化产物的合成提供了可迁移的理性设计框架。
尤其值得关注的是，GapN介导的NADPH自给回路绕过了通常通过强化戊糖磷酸途径所引发的碳损失与生长抑制难题，在不牺牲生物量的前提下实现了辅因子的高效再生。这一思路可广泛应用于其他高还原度产物（如类黄酮、萜类等）的微生物合成。此外，研究中开发的RBS精确调控与Gmd定向进化工具，为后续自动化设计、组合优化提供了模块库资源。
展望未来，该体系向产业化迈进仍需解决几个核心问题：一是高细胞密度发酵中氧传递与混合效率的工程放大效应；二是乳糖诱导策略的完全摒弃仍需构建应答更灵敏的自诱导或群体感应调控回路，进一步简化过程控制；三是将途径拓展至其他高值岩藻糖基化寡糖，如3-FL、双岩藻糖基乳糖等，实现在同一平台上多产品柔性切换。若能进一步集成基于组学的数字孪生模型，模拟预测最优代谢景观，将极大加速“设计-构建-测试”循环。可以预见，随着合成生物学与代谢工程的深度融合，2′-FL及系列HMOs的全生物合成将真正跨越经济关，惠及更广大的婴幼儿群体。
参考来源
Li M, Li C, Hu M, Zhang T. Metabolic engineering strategies of de novo pathway for enhancing 2′-fucosyllactose synthesis in *Escherichia coli*. *Microbial Biotechnology*, 2022. DOI: 10.1111/1751-7915.13977.
DOI: 10.1111/1751-7915.13977