来源：Protein Sci | 编译：DNA Lab Space
微生物耐药性问题日益严峻，群体感应（Quorum Sensing, QS）系统作为细菌和真菌致病性的重要调控机制，已成为新型抗感染药物研发的热点靶点。内酯酶能够水解群体感应信号分子——N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs），从而淬灭病原菌的致病行为。然而，天然内酯酶普遍存在稳定性差、催化效率低等缺陷，限制了其实际应用。本研究从一株内生真菌——假单胞曲霉（Aspergillus pseudonomiae）中鉴定并表征了一种新型稳定内酯酶，该酶不仅具有广谱的AHL降解活性，还展现出显著的抗细菌和抗真菌特性，为开发基于群体感应淬灭的生物防治策略提供了新的酶学工具。
群体感应是微生物通过分泌和感知特定信号分子来协调群体行为的一种通讯机制。许多病原细菌和真菌依赖AHLs或相关信号分子调控生物膜形成、毒素分泌和耐药性产生等毒力表型。传统的抗菌策略往往直接杀死病原微生物，容易诱发耐药性；而群体感应淬灭策略通过降解信号分子，在不影响微生物生存的前提下抑制其致病能力，因此被认为是应对耐药性危机的潜在新途径。内酯酶是群体感应淬灭酶中研究最为广泛的一类，能够通过水解AHLs的内酯环使其失活。目前已从多种细菌、古菌和真菌中发现了内酯酶，但多数酶的稳定性和催化效率难以满足实际应用需求。特别是来自极端环境或特殊生态位的内酯酶，往往具备独特的分子适应性，有望克服上述瓶颈。内生真菌长期与植物共生，其代谢酶类通常具有优异的生物化学稳定性，然而关于内生真菌来源内酯酶的研究尚不充分。基于此，该研究聚焦于植物内生真菌Aspergillus pseudonomiae，旨在发掘新型稳定内酯酶并解析其功能特性。
研究人员首先以已知内酯酶序列为探针，在Aspergillus pseudonomiae的基因组中进行同源搜索，筛选出一个潜在的金属内酯酶基因。随后，将该基因克隆至表达载体中，并在Escherichia coli中实现异源可溶表达。通过镍离子亲和层析和凝胶过滤层析两步纯化，获得了高纯度重组蛋白。酶学表征实验采用对硝基苯酚标记的AHL类似物作为底物，测定了酶的最适pH、最适温度以及动力学参数\(k_{cat}\)和\(K_m\)。同时，通过圆二色谱和差示扫描荧光法评估了该酶在不同温度、pH条件以及有机溶剂存在下的构象稳定性。底物特异性实验覆盖了不同酰基链长度（C4-C14）和不同取代基的AHLs。此外，研究人员还利用微量稀释法和琼脂扩散法分别测定了该酶对革兰氏阴性菌Pseudomonas aeruginosa、革兰氏阳性菌Staphylococcus aureus以及真菌Candida albicans的生长抑制活性，并通过高效液相色谱验证了酶解产物的生成。最终，研究人员解析了该酶的三维晶体结构，结合定点突变和分子对接分析了其底物识别与催化的分子机制。
研究结果显示，该内酯酶属于金属β-内酰胺酶超家族，具有典型的αβ/βα夹心结构域，活性中心含有两个锌离子。酶学动力学分析表明，该酶对短链和中链AHLs具有较高的催化效率，其中对C6-AHL的\(k_{cat}/K_m\)值可达\(10^5\) \(\text{M}^{-1}\text{s}^{-1}\)量级。稳定性实验显示，该酶在pH 5.0–10.0范围内保持超过80%的活性，在60°C下孵育1小时后残余活性仍高于70%，显著优于目前已报道的多数内酯酶。此外，该酶在10%（v/v）甲醇、乙醇和二甲基亚砜中表现出良好的耐受性。抗菌实验表明，该酶蛋白本身并不直接杀死细菌或真菌，但能够显著抑制P. aeruginosa的生物膜形成和绿脓菌素产生，同时降低C. albicans的菌丝形成能力——这些表型均受群体感应信号分子调控。高效液相色谱分析证实，该酶能够高效水解P. aeruginosa的主要信号分子C4-HSL和3-oxo-C12-HSL，以及真菌群体感应相关分子法尼醇的类似物。晶体结构分析揭示了该酶具有一个相对疏水的底物结合口袋，能够容纳不同链长的AHL底物；定点突变实验进一步确认了保守的HxHxDH基序和天冬氨酸残基在锌离子配位和催化过程中的关键作用。
该研究报道的内酯酶不仅在生化性质上具备突出的稳定性优势，还展示了广谱的群体感应淬灭功能，兼具抗细菌和抗真菌活性，具有重要的理论研究价值和实际应用潜力。与已报道的内酯酶相比，该酶在宽pH范围和高温条件下的稳定性使其更适用于环境复杂的实际场景，例如农业生物防治或医疗器械表面抗生物膜涂层。然而，目前的研究仍处于体外和分子水平，该酶在体内环境中是否能够有效淬灭病原菌的群体感应并减轻感染，尚需通过动物模型或植物活体实验进行验证。此外，该酶对真菌群体感应信号分子的作用机制仍不完全明确，尤其是其是否通过直接降解法尼醇或干扰其他信号通路来抑制真菌形态转换，还需进一步探究。未来可通过蛋白质工程手段进一步优化该酶的催化活性和底物特异性，并探索其与抗生素或抗真菌药物的联用效果，以期为解决微生物耐药性难题提供新的思路与工具。
参考来源：Ben Tovim D, Trofimyuk O, Yariv E, Prag G, Afriat-Jurnou L. The characterization of a new stabilized lactonase from the endophytic fungi Aspergillus pseudonomiae with anti-bacterial and anti-fungal properties. Protein Sci, DOI: 未提供.
