来源：AMB Express | 编译：DNA Lab Space
右旋糖酐酶是一类能够特异性水解右旋糖酐中α-1,6糖苷键的工业酶制剂，在制糖、医药及食品行业具有重要应用价值。然而，天然菌株产酶水平低、发酵成本高，严重制约了其工业化推广。近日，一项发表在《AMB Express》上的研究，采用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术结合黑曲霉异源表达系统，成功实现了右旋糖酐酶的高效表达，为工业酶制剂的菌种改良提供了新思路。
研究背景
右旋糖酐酶（Dextranase，EC 3.2.1.11）可广泛应用于甘蔗制糖过程中右旋糖酐的清除，也可用于预防龋齿及作为医药用右旋糖酐的分子量调节剂。目前工业上主要依靠真菌发酵生产右旋糖酐酶，但传统生产菌株如绳状青霉等存在产酶活力低、发酵周期长、酶学性质不稳定等瓶颈。近年来，基因工程和合成生物学技术的快速发展，为异源表达工业酶提供了重要途径。黑曲霉（Aspergillus niger）作为公认安全（GRAS）的工业宿主，具有强大的蛋白分泌能力和完善的翻译后修饰系统，是理想的外源蛋白表达平台。然而，外源基因在黑曲霉中的表达水平往往受到启动子强度、密码子偏好性及蛋白降解等多重因素影响。如何将高效的菌株诱变育种策略与异源表达技术有机结合，成为提升右旋糖酐酶产量的关键科学问题。本研究正是基于这一思路，先利用ARTP对黑曲霉宿主菌进行诱变，再转入右旋糖酐酶基因，以期获得高产工程菌株。
研究方法
研究人员首先从已知来源克隆了右旋糖酐酶基因（dex），并对其编码序列进行密码子优化以适应黑曲霉表达系统。随后，构建了由强启动子调控的目标基因表达盒，并利用农杆菌介导的转化方法将表达盒随机整合至黑曲霉基因组中。为确保表达效率，研究还引入了适当的信号肽序列以引导蛋白分泌至胞外。
在获得重组菌株后，研究进一步采用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术对异源表达菌株进行多轮诱变处理。ARTP是一种基于大气压放电产生高活性等离子体的新型诱变手段，能够造成DNA多位点损伤，诱发高频突变，且操作条件温和、对环境友好。研究人员通过控制等离子体处理时间（如1 min、2 min、3 min）和功率，构建了突变体库，并采用96孔板高通量筛选策略，以右旋糖酐酶底物显色法初步甄别高酶活突变株。对初筛获得的阳性菌株，再进行摇瓶复筛，通过测定发酵液中的酶活力（U/mL）及蛋白浓度，综合评估其产酶性能。
此外，研究还通过荧光定量PCR和Western blot技术，从转录和翻译水平分析了突变株中右旋糖酐酶基因的表达差异，并结合基因组重测序分析，初步定位了潜在的关键突变位点。所有发酵实验均在优化后的培养基条件下进行，确保数据具有可比性。
研究结果
经过ARTP诱变和异源表达的联合策略，研究最终获得了一株右旋糖酐酶高产突变株。摇瓶发酵结果显示，突变株的胞外右旋糖酐酶活力较原始重组菌株提高了约3.2倍，较野生型生产菌株提高超过10倍。发酵上清液中的总蛋白含量也显著上升，且SDS-PAGE分析显示，在预期分子量位置出现明显的目标蛋白条带，证实右旋糖酐酶被成功高效分泌。
进一步对突变株与出发菌株进行转录水平比较，发现突变株中dex基因的mRNA丰度显著高于出发菌株，说明ARTP诱变可能影响了启动子区域或相关转录调控因子，从而增强了基因的转录效率。Western blot结果也印证了蛋白表达量的提升。基因组重测序数据揭示，突变株中存在多个单核苷酸多态性（SNP）位点，其中一些位于与蛋白分泌途径相关的基因区域，推测这些突变可能协同增强了蛋白折叠与分泌能力，减少了外源蛋白在内质网或液泡中的降解。
酶学性质分析表明，重组右旋糖酐酶的最适pH约为5.0，最适温度约为55℃，在pH 3.0–7.0范围内具有良好稳定性，且对工业蔗汁中的实际底物表现出较高的水解效率。这些特性表明该工程菌株所产右旋糖酐酶具备良好的工业应用潜力。
讨论与展望
本研究成功将ARTP诱变与异源表达相结合，显著提升了右旋糖酐酶在黑曲霉中的产量。这种“表达盒整合+随机诱变”的策略，无需精确设计特定调控元件，即可通过全基因组范围的突变来筛选获得表达增强菌株，具有较强的通用性和实用性。更重要的是，研究揭示了ARTP诱变可能通过影响蛋白分泌途径相关基因来间接提高外源蛋白产量，这为理解真菌蛋白高效表达的分子机制提供了新线索。
当然，当前研究仍存在一些局限。例如，突变株中关键SNP的功能尚未逐一验证，诱变导致的非预期代谢负担也可能影响菌株的遗传稳定性。后续可通过CRISPR/Cas9介导的位点特异性编辑，将有益突变精准整合至高产菌株，从而进一步优化菌株性能。此外，将ARTP诱变与启动子工程、核糖体工程等合成生物学工具联合应用，或可构建更加高效的黑曲霉细胞工厂。
总之，本研究为右旋糖酐酶的工业化生产提供了高性能菌株，同时也为其他工业酶在丝状真菌中的异源表达提供了可借鉴的诱变育种范例。
参考来源
Huang X, Yang L, Zhang W, Yang D, Guo H. Atmospheric room-temperature plasma mutagenesis and heterologous expression of dextranase in Aspergillus niger. AMB Express. DOI: 待补充。