来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**：恶臭假单胞菌（*Pseudomonas putida*）凭借其突出的氧化还原能力和环境耐受性，已成为工业生物技术中的理想底盘。然而，该菌株长期受限于基因激活工具的匮乏，难以对复杂代谢途径进行精细操控。Cholpisit Kiattisewee 等研究人员开发出名为 PORTABLE 的可移动细菌 CRISPR 转录激活系统，巧妙融合失活 Cas9 与细菌 RNA 聚合酶ω亚基，在多种 *P. putida* 菌株中实现高效、可诱导且正交的多基因协同激活，并成功将甲羟戊酸与萜类化合物产量提升数倍至数十倍，为代谢工程提供了即装即用的通用型调控平台。
研究背景
恶臭假单胞菌是一种革兰氏阴性土壤细菌，以其丰富的还原力供应、高耐受氧化应激和能够代谢多种芳香族化合物而著称。其天然拥有戊糖磷酸途径与 ED 途径的独特组合，可高效产生 NADPH，为还原性产物的合成提供了充足的驱动力。因此，该菌已作为生产有机酸、氨基酸、萜类以及生物塑料等重要化合物的底盘被广泛研究。然而，与大肠杆菌等模式微生物相比，*P. putida* 在合成生物学工具箱方面依然贫瘠，尤其缺乏正交、可调且能同时激活多个基因的转录调控元件。传统上，研究者通过替换启动子或引入外源诱导型调控系统来增强基因表达，但这些方法往往需要染色体编辑，操作周期长，难以同时扰动多个靶点，且强制性的高表达会引发代谢负担和生长抑制，不利于平衡细胞生长与产物合成。
CRISPR 转录激活（CRISPRa）技术为上述难题提供了全新思路。它将核酸酶失活的 Cas9（dCas9）与转录激活域融合，在单向导 RNA（sgRNA）引导下靶向启动子区域，招募 RNA 聚合酶以激活基因转录。真核生物中的 CRISPRa 已十分成熟，而细菌系统则进展缓慢，主要是因为细菌转录调控机制差异较大，真核激活域在细菌中往往无效。近年来，通过将 dCas9 与细菌 RNA 聚合酶ω亚基（RpoZ）、转录因子 SoxS 等融合，研究者在大肠杆菌中初步证实了细菌 CRISPRa 的可行性，但在假单胞菌这样的非模式菌中，内源性激活域的选择、sgRNA 靶点设计规则和系统的可移植性几乎仍是空白。
针对这一瓶颈，Kiattisewee 等人系统设计了“可移动细菌 CRISPR 转录激活”（PORTABLE）系统。他们聚焦于 *P. putida* KT2440 及其工业衍生菌株，试图构建一套无需基因组整合、能通过接合转移在不同菌株间直接“移植”的 CRISPRa 工具，并验证其同时调控多基因代谢途径的能力。这项工作不仅填补了假单胞菌 CRISPRa 工具缺口，更为跨菌株的标准化代谢工程提供了范式。
研究方法
研究团队采用了分步工程策略，依次完成激活域筛选、sgRNA 优化、正交诱导设计、多基因阵列构建和系统可移动性验证，最终将其应用于实际代谢途径的增产。
**激活域筛选与质粒构建**
首先，作者选取了多个已报道在细菌中具有转录激活潜力的蛋白结构域，包括 RNA 聚合酶ω亚基（RpoZ）、转录因子 SoxS、抗终止蛋白 AsiA 以及噬菌体蛋白 gp33 等，将这些结构域与催化失活的 Cas9 蛋白 C 末端融合。融合蛋白的编码基因被置于鼠李糖诱导型启动子 P*rhaBAD* 的控制之下，克隆至广宿主质粒载体，以便同时在 *P. putida* 和大肠杆菌中复制。同时，构建表达 sfGFP 荧光报告基因的测试菌株，其启动子为组成型弱启动子，可清晰地反映转录激活程度。
**sgRNA 靶点设计与优化**
为系统探索激活规律，团队围绕报告基因启动子的 -35 区、-10 区及其上游区域，设计了一系列靶向不同间距的 sgRNA。这些 sgRNA 由第二诱导系统（如 IPTG 诱导启动子或组成型启动子）转录，以独立调节 dCas9 融合蛋白与 sgRNA 的表达水平。通过测量各组合下的荧光强度，研究者得以评估不同激活域在不同诱导条件下的激活倍数和渗漏水平，并确定最优的 sgRNA 靶点窗口。
**正交与多重基因激活设计**
为实现复杂途径的多基因协同激活，团队构建了基于 tRNA 加工机制的 sgRNA 阵列。单一转录本携带多个串联的 tRNA-sgRNA 结构，经细胞内源 tRNA 加工酶切割后释放出多个成熟 sgRNA。利用正交的诱导型启动子（如鼠李糖与 IPTG 分别调控 dCas9 与 sgRNA 阵列），系统可独立调控激活模块的表达，避免与宿主自身调控网络之间的串扰。
**可移动性评估**
为验证 PORTABLE 的“便携”特性，研究组将整个 CRISPRa 系统（包括 dCas9-激活域与 sgRNA 表达盒）构建在 RK2 等广宿主接合质粒上。以 *E. coli* S17-1 作为供体菌，通过接合作用将质粒转移至 *P. putida* KT2440、NBRC14164 及多种不同来源的工业菌株中，在无抗生素选择压力或低拷贝状态下检测报告基因的激活水平，以模拟实际应用场景。
**代谢途径应用**
该系统最终被用来激活两种典型代谢途径。一是甲羟戊酸途径，靶向乙酰乙酰辅酶 A 硫解酶（AtoB）、HMG-CoA 合酶（HMGS）和 HMG-CoA 还原酶（HMGR）三个限速酶基因，考察甲羟戊酸产量的变化；二是紫穗槐二烯合成途径，通过激活途径关键酶编码基因，评估倍半萜类化合物的产量提升情况。所有产物均通过气相色谱或液相色谱进行定量分析。
研究结果
**dCas9-ω 融合体表现出最优激活性能**
在比较多种激活域时，dCas9 与 RNA 聚合酶ω亚基（RpoZ）的融合蛋白展现出最高效的转录激活能力。在鼠李糖诱导下，靶向最优位点的 sgRNA 可使 sfGFP 荧光强度提升超过 50 倍，且非诱导条件下渗漏极低，实现了良好的真“关”状态。相比之下，SoxS 等激活域仅提供十余倍激活，且具有一定的本底表达。这表明直接招募 RNA 聚合酶核心酶亚基的策略在 *P. putida* 中更为有效。
**sgRNA 靶向 -35 区域可获最高激活强度**
系统扫描发现，当 sgRNA 靶向启动子 -35 区上游约 40~60 bp 位置时激活效果最佳，而直接靶向 -35 盒或 -10 盒则因可能干扰固有转录起始而导致激活减弱。这一规律在不同启动子背景下均成立，为后续任意基因的 sgRNA 设计提供了较为通用的准则。此外，激活强度可通过同时改变鼠李糖与
DOI: 10.1016/j.ymben.2021.04.002