来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
CRISPR-Cas9与P450协同驱动解脂耶氏酵母高效合成中链α,ω-二醇
#### 导语
中链α,ω-二醇是合成高端聚酯、聚氨酯和香料的关键单体，其绿色制造一直备受关注。解脂耶氏酵母是公认的油脂化学品合成底盘，但其烷烃双末端氧化能力常因代谢流失而产量低下。近期，研究人员通过CRISPR-Cas9介导的代谢网络重构与P450烷烃单加氧酶的系统过表达，成功将酵母的烷烃ω-氧化通量导向α,ω-二醇的定向积累，使产物滴度提升数十倍。该策略不仅彰显了合成生物学在复杂化学官能化反应中的威力，也为烷烃生物精炼开辟了全新范式。
#### 研究背景
α,ω-二醇（HO–(CH₂)ₙ–OH）是一类两端带有羟基的直链脂肪族化合物，其中中链成员（n=6~14）因独特的柔韧性和疏水-亲水平衡，被广泛应用于高级聚酯、聚碳酸酯、增塑剂、化妆品以及自修复材料等领域。特别是1,10-癸二醇和1,12-十二烷二醇，已成为生物基工程塑料PBAT（聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯）和生物可降解润滑剂的重要成分。目前，这些二醇主要依赖多步化学合成，例如从丁二烯经氢甲酰化或从蓖麻油裂解产物经金属催化加氢获得，工艺中存在高温高压、贵金属催化剂以及副产物多等缺陷，难以契合“双碳”目标下的绿色化工要求。
微生物催化烷烃选择性氧化是极具吸引力的替代路线。在自然界，解脂耶氏酵母（*Yarrowia lipolytica*）能够通过细胞色素P450单加氧酶启动烷烃的ω-氧化：烷烃首先被单加氧酶氧化为脂肪醇，继而在醇脱氢酶和醛脱氢酶作用下生成脂肪酸。理论上，若在另一端的ω-位也发生同样反应，即可生成α,ω-二酸，而如果中间产物ω-羟基脂肪酸被还原或末端氧化被部分截断，则可积累α,ω-二醇。然而，该菌内源的β-氧化途径十分强劲，会迅速将脂肪酸及其羟基化衍生物降解为乙酰辅酶A，导致二醇几乎无法积累。早期的代谢工程尝试通过敲除单个β-氧化基因或过表达醇脱氢酶，仅能获得痕量产物，距离工业化要求相距甚远。
该研究的突破在于，团队不再满足于局部修补，而是借助CRISPR-Cas9高通量编辑技术对脂质代谢网络进行全局重编程，同时配合高效的P450烷烃单加氧酶过表达模块，将胞内代谢流从“完全降解”强行扭转为“双末端选择性羟化-保留”。这一策略的成功实施，为解脂耶氏酵母合成α,ω-二醇扫清了代谢障碍。
#### 研究方法
研究者设计了一条环环相扣的代谢工程路线，从底盘评估、基因编辑、酶工程到发酵优化，形成完整的技术闭环。
**平台菌株与基因编辑系统**
以解脂耶氏酵母Po1f菌株为出发宿主，该菌具备较强的烷烃同化和油脂累积能力。基因编辑依托一套经密码子优化的CRISPR-Cas9系统，利用自主复制的pCRISPRyl质粒携带Cas9表达盒和靶向特定基因的sgRNA。供体DNA片段上下游各含有约500 bp同源臂，通过同源重组修复实现无痕敲除或整合。为加速多基因迭代编辑，研究者在每一轮编辑后通过反筛标记回收筛选标签，避免了筛选标记残留对代谢的干扰。
**代谢途径重构**
针对β-氧化通路的全线阻断，团队同时或分步敲除了核心基因：（1）编码酰基辅酶A氧化酶的六个同工酶基因POX1~POX6，消除第一步脱氢反应；（2）多功能的烯酰辅酶A水合酶/羟酰辅酶A脱氢酶基因MFE1，切断水合与二次脱氢；（3）酮脂酰辅酶A硫解酶基因POT1，阻断末端乙酰辅酶A的释放。由此，一旦生成ω-羟基脂肪酸辅酶A，便无法进入β-氧化螺旋。此外，还删除了脂肪醇氧化酶FAO1基因，抑制脂肪醇向脂肪酸的旁路流失；下调或失活内源醇脱氢酶/醛脱氢酶的部分同工酶，使ω-羟基脂肪醛能够被更特异性地还原为二醇而不是过氧化。
**P450单加氧酶模块的强化**
P450烷烃单加氧酶是催化限速步骤的关键酶。研究选取源自*Yarrowia lipolytica*自身和高活性的*Candida tropicalis*的CYP52家族成员，包括CYP52A13、CYP52A17等，与同源的NADPH–细胞色素P450还原酶（NCP）共表达。通过启动子工程，采用强组成型启动子pGPD或诱导型启动子pLIP2，调控单加氧酶及还原伴侣蛋白的表达比例。为提高基因剂量，表达盒以多拷贝整合至rDNA位点或Zeta序列，实现基因组层面的稳定高表达。同时，在内质网膜上进行融合表达标签改造，增强P450的膜定位和电子传递效率。
**发酵与产物分析**
摇瓶发酵以矿物盐培养基添加葡萄糖为碳源和能量辅助，以正十二烷、正癸烷等液体烷烃作为底物和产物萃取相，形成双相发酵体系。发酵罐放大采用5 L机械搅拌罐，控制pH 5.5、溶解氧30%以上，并在对数生长期补加烷烃。定期取样，使用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测α,ω-二醇、ω-羟基脂肪酸和副产物二酸。最终通过核磁共振氢谱确定产物结构。
#### 研究结果
多维度代谢改造使菌株的性能呈阶梯式跃升。
**代谢阻断解除降解瓶颈**
仅敲除全部六个POX基因的菌株，在十二烷为底物时即从发酵液中检出微量1,12-十二烷二醇，但主要积累物仍为α,ω-十二烷二酸。当进一步删除MFE1和POT1后，β-氧化通量完全被切断，ω-羟基十二酸无法降解，却转化为大量二酸，说明碳流被推到末端氧化路径。只有同时削弱醇/醛脱氢酶活性并高表达ω-羟基脂肪酸还原酶或醇脱氢酶逆反应，才使代谢流卡在二醇节点。最终，经系统组合的底盘菌在删除β-氧化全部核心基因、FAO1以及部分内源脱氢酶后，自身积累的1,12-十二烷二醇达到0.35 g/L，而野生型检测不到。
**P450过表达解锁催化速率**
在重构的底盘上，单独过表达CYP52A13使二醇产量提升至1.2 g/L，过表达CYP52A17配合NCP则达到2.1 g/L。进一步发现，CYP52与NCP的表达比例对催化效率有显著影响：当NCP基因拷贝数为P450的2~3倍时，电子传递顺畅，副产物二酸的比例下降约40%。最佳组合为双拷贝CYP52A17融合标签蛋白与三拷贝NCP，构建的工程菌株YMD-17菌株在摇瓶中1,12-十二烷二醇滴度高达2.8 g/L，比初始工程菌提升了80倍以上。
**底物谱与发酵放大**
菌株YMD-17对不同链长正构烷烃（C8~C16）均呈活性，其中对十二烷选择性最佳，但也成功合成了1,10-癸二醇（1.5 g/L）和1,14-十四烷二醇（1.2 g/L），展现出平台潜力。5 L发酵罐分批补料培养，细胞密度OD₆₀₀达到60后，控速流加葡萄糖与十二烷，维持适度生长与产物生成。发酵96 h，1,12-十二烷二醇产量攀升至4.2 g/L，产率达到0.12 g/g十二烷。这是目前公开文献中解脂耶氏酵母从头合成中链α,ω-二醇的最高水平。副产物二酸被有效压制在0.4 g/L以下，表明代谢通路由“过度氧化”成功切换为“双羟化保留”。
此外，转录组分析证实，β-氧化基因转录丰度接近于零，而P450和还原酶转录水平较出发菌株提高了15~30倍，胞内ATP和NADPH供应未受明显扰动，菌株生长速率仅下降约15%，体现了较好的代谢稳健性。
#### 讨论与展望
该项研究通过“堵塞漏端、拉升高效催化”的双重策略，圆满解决了长期困扰微生物合成α,ω-二醇的代谢流失与催化活性不足两大难题。结果表明，彻底截断β-氧化是积累双末端功能化产物的前提条件，而P450单加氧酶与还原伴侣的比例优化则是决定通量强度和产物纯度的关键。该设计理念不仅适用于中链α,ω-二醇，对于二酸、ω-羟基酸乃至二元胺的高效生物合成同样具有借鉴价值。
然而，从4.2 g/L走向工业化还需要跨越几道障碍。其一，P450单加氧酶依赖NADPH和分子氧，高密度发酵时的氧传质和辅因子再生将是放大的瓶颈；其二，产物α,ω-二醇在发酵液中的溶解度低，双液相体系虽有利于原位萃取，但对细胞膜可能存在毒性，需要适应性进化或耐受性改造；其三，代谢通量重定向后，细胞内部脂质平衡可能被打破，长期遗传稳定性有待评估。
展望未来，可以耦合基于生物传感器的动态调控回路，在二醇积累到一定阈值时自动下调脱氢酶表达，进一步降低副反应；引入非天然辅因子偏好性P450，缓解NADPH压力；亦可借鉴光催化或电催化手段，为P450提供电子，实现脱离细胞生长偶联的静息细胞催化。随着合成生物学工具在解脂耶氏酵母中的日益丰富，这支非传统酵母有望成为烷烃化学化制造的主力军，推动高分子材料单体制备迈向碳中和。
#### 参考来源
Y. Kim, Won Yoon Hwan Choi, Eun-jung Kim, Byung-Gee Kim, H. Yun. Metabolic engineering of *Yarrowia lipolytica* for enhanced microbial production of medium-chain α, ω-diols from alkanes via CRISPR-Cas9 mediated pathway optimization and P450 alkane monooxygenase overexpression. *Frontiers in Bioengineering and Biotechnology*, 2025. DOI: 10.3389/fbioe.2025.1695661
DOI: 10.3389/fbioe.2025.1695661