来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）作为卟啉化合物合成的关键前体，在精准农业、肿瘤光动力治疗等领域需求激增。传统化学合成法存在污染重、成本高等瓶颈，而微生物发酵法因代谢流难以精准调控始终未能突破工业化阈值。Ye等人发表于《Journal of Biological Engineering》的最新研究，利用CRISPR/Cas9介导的迭代基因编辑技术，对大肠杆菌BW25113进行了多重基因敲除与途径模块化改造，首次在该菌株中实现了5-ALA的高效分泌积累，补料分批发酵产量突破18 g/L，为绿色生物制造提供了全新底盘方案。
研究背景
5-氨基乙酰丙酸是生物体内四吡咯化合物（血红素、叶绿素、维生素B12等）生物合成的通用前体。在农业领域，它可作为选择性、可降解的环境友好型除草剂和植物生长调节剂；在医药领域，5-ALA衍生物已获批用于脑胶质瘤、膀胱癌等的光动力诊断与治疗。全球市场规模预计2028年将达到4.6亿美元，年均复合增长率超过7%。然而，化学合成需使用有毒原料与极端反应条件，产物纯化困难，严重制约其可持续供给。
微生物体内天然存在两条5-ALA合成途径：C4途径由5-氨基乙酰丙酸合酶（ALAS）催化琥珀酰辅酶A与甘氨酸一步缩合，常见于紫色非硫细菌；C5途径则以谷氨酸为起点，经谷氨酰-tRNA还原酶（HemA）和谷氨酰胺-1-半醛氨基转移酶（HemL）三步转化生成5-ALA，广泛存在于植物和多数细菌中。大肠杆菌作为经典模式底盘，虽具备完整的C5途径（由hemA和hemL等基因编码），但其碳代谢流主要流向有机酸副产物（乙酸、乳酸等）和TCA循环的完全氧化，天然菌株胞外5-ALA积累量极低（<20 mg/L）。同时，HemA酶受血红素终产物的反馈抑制严格调控，进一步限制了代谢通量。
近年来，代谢工程手段被用于提升5-ALA微生物合成效率，主要策略包括：过表达抗反馈抑制的HemA突变体，引入异源C4途径，以及敲除竞争支路。但传统同源重组敲除效率低、周期长，难以实现多基因协同扰动。CRISPR/Cas9系统的出现使无痕、迭代、多靶点的基因组编辑成为可能，为系统重塑细胞代谢网络提供了强大工具。该研究正是着眼于利用CRISPR/Cas9技术，对大肠杆菌BW25113开展全局代谢途径手术式改造，以解除副产物溢流和前体竞争，最终迫使碳流定向注入5-ALA合成管线。
研究方法
研究团队设计了一条“减负-强化-释放”三阶段工程路线，实验技术框架覆盖从分子工具构建到多尺度发酵的全流程。
**底盘细胞与基因编辑工具**
以大肠杆菌BW25113为出发菌株，采用双质粒CRISPR/Cas9系统：pCas9质粒携带温敏复制子和Cas9蛋白表达框，pTargetF质粒含有针对靶基因的特异性N20序列与同源修复模板。针对乳酸脱氢酶基因（ldhA）、磷酸转乙酰酶基因（pta）、丙酮酸氧化酶基因（poxB）、琥珀酰辅酶A合成酶α亚基基因（sucC）和ALA脱水酶基因（hemB）分别设计sgRNA，各靶点均选取PAM序列上游20 bp区域，通过Gibson组装构建至线性化pTargetF载体。同源臂长度设定为500 bp，以实现高效无痕敲除。
**迭代敲除与验证**
每轮编辑流程为：将pCas9电转导入感受态细胞，阿拉伯糖诱导表达Cas9后，制备电转感受态；再导入含靶向sgRNA与同源臂的pTargetF质粒；在卡那霉素和壮观霉素双抗平板上筛选转化子，通过菌落PCR与测序验证目的基因缺失。随后在42℃培养消除温敏型pCas9，并借助IPTG诱导的pTargetF消除系统移除编辑质粒，获得无抗性标记的中间菌株。依次敲除ldhA、pta、poxB、sucC，并在最后一轮弱化hemB（以保留了血红素合成能力的突变体hemB*替代，或通过低强度启动子替换原有启动子以避免致死），累计获得五基因修饰的底盘菌株E. coli BW25113 Δ5。
**合成途径强化模块**
在C5途径强化方面，从鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）中克隆获得已报道能解除反馈抑制的hemA*基因（编码GluTR S145F突变体），与大肠杆菌内源hemL基因通过RBS优化串联，置于中等拷贝数质粒pACYCDuet-1的T7启动子下，构建pA-R*L表达载体。同时，将来源于类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）的C4途径基因hemA_Rs（编码ALAS）单独装载至pETDuet-1，获得pE-ALAS，用于比较两种途径在相同底盘中的产能差异。
**发酵条件与参数监测**
摇瓶培养采用MM9矿物盐培养基，添加20 g/L葡萄糖及适宜抗生素，37℃、220 rpm培养至OD600≈0.6时加入0.1 mM IPTG诱导，26℃继续培养48 h。补料分批发酵在5 L发酵罐中进行，初始碳源为30 g/L葡萄糖，通过溶解氧-搅拌级联与pH-stat自动补加补料液（500 g/L葡萄糖），控制pH 6.8、溶氧30%以上。每隔4 h取样，采用改进的Ehrlich试剂比色法检测5-ALA浓度，HPLC分析有机酸副产物和残糖，并计算产率与生产强度。
研究结果
通过系统性基因扰动，研究清晰展示了“代谢卸压”对5-ALA合成的累积增益效应。
**有机酸副产物被显著抑制**
单基因敲除株BW25113 ΔldhA摇瓶发酵48 h后，乳酸分泌量从野生型的8.2 g/L降至0.3 g/L以下，5-ALA积累量仅有小幅上升（0.15 g/L）。双敲除ΔldhA Δpta菌株的乙酸积累减少73%，5-ALA达到0.48 g/L；进一步敲除poxB后，丙酮酸衍生的有机酸总量下降86%，5-ALA产量增至1.24 g/L。当琥珀酰辅酶A合成酶基因sucC被删除，TCA循环的碳流氧化速率放缓，更多琥珀酸积累并向5-ALA合成方向转化，使ΔldhA Δpta ΔpoxB ΔsucC四基因敲除株（Δ4）的5-ALA产量跃升至2.87 g/L，比野生型提高超过140倍。该结果直观证实了阻断分枝代谢对前体供应的决定性作用。
**途径强化与hemB原位弱化协同增效**
在Δ4底盘基础上表达pA-R*L质粒，C5途径通量得到直接加强，摇瓶5-ALA产量提升至6.52 g/L，同时细胞内血红素浓度上升。然而，hemB编码的ALA脱水酶将部分产物转化为卟啉原，造成隐性损耗。团队采用CRISPR/Cas9介导的启动子工程，将hemB天然启动子替换为低强度组成型启动子J23105，使ALA脱水酶活性下降约90%但未完全丧失，保证菌株正常生长。最终获得的工程菌株E. coli BW25113 Δ4::P_J23105-hemB pA-R*L（命名为ALA-05），摇瓶5-ALA产量达8.93 g/L，产率为0.45 g/g葡萄糖，接近最大理论得率的43%。
**补料分批发酵突破产量瓶颈**
将ALA-05在5 L发酵罐中进行高密度培养，通过指数流加方式控制比生长速率，并在OD600≈60时低温诱导。发酵108 h后，5-ALA终浓度达到18.6 g/L，总产率0.37 g/g葡萄糖，生产强度0.17 g/L/h。HPLC分析显示，发酵液中几乎检测不到乳酸、甲酸，乙酸浓度控制在1.2 g/L以下，碳流有效率超过78%。相比之下，含有异源C4途径pE-ALAS的等价底盘仅积累10.4 g/L，且胞内ATP水平下降明显，表明强化内源C5途径更适配于该大肠杆菌底盘的能荷平衡。
**关键酶活性与代谢组学验证**
酶活测定显示，HemA*的体外活性达野生型HemA的8.3倍，Ki值对血红素的耐受浓度提高了4倍；HemL活性也因基因剂量提升而增加2.6倍。细胞内代谢物分析表明，工程菌株胞内谷氨酸库显著降低，而5-ALA浓度比野生型高出3个数量级，证明碳代谢流被强力拽入目标途径。
讨论与展望
该研究充分展现了CRISPR/Cas9系统在大肠杆菌多基因迭代编辑中的高效性与洁净度。通过在基因组层面完成“减副产、缓氧化、控消耗”三步操作，并同步强化合成速率决定酶的表达，研究者将大肠杆菌KW25113从5-ALA的“微量生产者”改造为高浓度分泌的细胞工厂，产量与产率均达到了当时国际报道的前列水平。尤其值得关注的是，原位弱化hemB而非完全敲除的策略，巧妙地平衡了产物保留与细胞生存需求，避免了外源血红素添加的额外成本，强化了产业应用可行性。
然而，从实验室走向商业化仍有几个关键瓶颈需突破：首先，18.6 g/L的发酵液5-ALA会产生较强渗透压与胞外抑制，后续需挖掘高效的外排蛋白（如RhtA、YbjE等）或构建设计优良的耐受性进化株；第二，发酵过程中仍存在一定程度的乙酸累积，提示需要进一步精细调控葡萄糖摄取速率与TCA循环通量，例如通过动态调控pfkA或gltA表达实现碳流的“分配”；最后，葡萄糖为基质的理论得率上限受限于C5途径的碳重排损耗，若在未来整合反向C4途径并通过辅因子工程实现NADPH的高效供给，或可推动产率向理论最大值逼近。
总之，该研究为多基因协同代谢改造提供了一个清晰、可复制的范式——CRISPR/Cas9无痕手术刀与模块化途径重塑的融合，将极大加速各类高值化学品微生物合成路线的构建与迭代。随着自动化基因编辑平台和深度学习代谢模型的发展，这种“设计-构建-测试-学习”的闭环，将把工业微生物的性能推向新的极限。
参考来源
Ye C, Yang Y, Chen X, et al. Metabolic engineering of *Escherichia coli* BW25113 for the production of 5-Aminolevulinic Acid based on CRISPR/Cas9 mediated gene knockout and metabolic pathway modification. *Journal of Biological Engineering*, 2022. DOI: 10.1186/s13036-022-00307-7.
DOI: 10.1186/s13036-022-00307-7