来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**
胞外多糖（EPS）是乳酸菌发酵乳制品中决定质构、风味及益生功能的关键代谢产物。然而，嗜热链球菌（*Streptococcus thermophilus*）的EPS合成途径复杂、调控节点分散，传统策略难以实现全局优化。近期发表于《Journal of Dairy Science》的一项研究，首次将CRISPR/dCas9基因调控系统引入该菌株，构建了可编程的多基因转录控制平台，对EPS合成途径进行了模块化、多层次的重编程。通过同时靶向多个限速酶基因，研究者不仅将EPS产量提升至新高度，还实现了分子量与单糖组成的定向调控，为工业发酵剂的精准代谢工程树立了新范式。
研究背景
嗜热链球菌是乳品工业中与保加利亚乳杆菌并称的“发酵剂双璧”，广泛用于酸奶和奶酪的生产。其分泌的胞外多糖（exopolysaccharide, EPS）能在发酵乳中充当天然增稠剂和稳定剂，赋予产品细腻的质构，减少对人工添加剂的依赖。更重要的是，部分EPS具有免疫调节、抗肿瘤和抗氧化等生物活性，是功能性乳制品开发的核心靶标。然而，嗜热链球菌野生菌株的EPS产量通常较低，且结构与功能之间构效关系不清晰，极大限制了其工业应用。
EPS的生物合成是一个由多基因协同控制的复杂过程。在嗜热链球菌中，关键基因簇 *eps* 编码糖基转移酶、聚合酶和链长决定蛋白等，而糖核苷酸前体（如UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖等）的供应又涉及中心碳代谢多个旁路途径。传统改造手段集中于单一基因的过表达或敲除，往往因代谢通量失衡导致生长受损或副产物积累，难以获得综合效益最大化。因此，亟需一种能够对多个靶点进行同步、可调控制的新型工具。
CRISPR/dCas9系统为此提供了理想解决方案。失活型Cas9蛋白（dCas9）在引导RNA（sgRNA）辅助下可特异性结合靶基因启动子或开放阅读框，物理阻碍RNA聚合酶转录延伸，从而实现基因表达的抑制（CRISPRi）；若将dCas9与转录激活因子融合，则可上调基因表达（CRISPRa）。该技术已在模式微生物中展现出多基因同步调控的巨大潜力，但在食品级乳酸菌中，尤其是嗜热链球菌这类遗传操作较为困难的菌株中，仍属空白。
研究方法
该研究的技术路线环环相扣，体现了理性设计与系统生物学的深度融合。
**1. 靶点选择与sgRNA设计**
研究者首先基于嗜热链球菌S-3菌株的全基因组序列和前期转录组数据，重构了EPS合成代谢网络。通过通量平衡分析（FBA）和通量控制系数计算，锁定三组关键节点：糖核苷酸前体供给模块（*galU*编码UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，*galE*编码UDP-半乳糖差向异构酶）、EPS重复单元组装模块（*epsE*编码引物糖基转移酶，*epsF*编码后续糖基转移酶）以及负调控因子模块（如转录抑制因子 *epsR*）。针对各基因的启动子区和起始编码序列，设计了一系列长度为20bp、脱靶评分最优的sgRNA，并利用CRISPR-Gold软件评估其结合的特异性。
**2. dCas9表达载体的食品级构建**
为避免抗生素抗性基因在食品体系中的残留风险，研究者采用胸腺嘧啶合成酶基因（*thyA*）作为选择标记，构建了互补型表达质粒pMG36e-dCas9。dCas9蛋白源自化脓链球菌，并分别与两个源自枯草芽孢杆菌的转录激活结构域（RemA）融合，构建CRISPRa工具；而CRISPRi仅表达dCas9本体。sgRNA表达盒通过强组成型启动子P3驱动，并以串联排列方式在同一载体中接入多个sgRNA单元，实现多基因同步调控。
**3. 发酵条件与动态调控策略**
重组菌株在改良M17乳糖培养基中进行摇瓶及5 L发酵罐补料培养。为匹配EPS合成的最佳时机，研究者将部分靶点的sgRNA表达置于对数中后期诱导的启动子（如PlacZ）下，利用乳糖浓度作为原位诱导信号，实现“先长菌体后产糖”的两阶段动态调控。发酵过程实时监测光密度（OD600）、乳酸浓度和残糖量，EPS粗品通过乙醇沉淀法提取，苯酚-硫酸法测定总糖含量，高效分子排阻色谱（HPSEC）测定分子量，高效液相色谱分析单糖组成。
**4. 多模块协同优化设计**
研究分为三个阶段：第一步，单独调控各模块，筛选对EPS产量影响最显著的单靶点或双靶点组合；第二步，将最优调控模式进行正交组合，构建三模块并行调控菌株；第三步，通过调整不同sgRNA的表达强度（改变启动子或核糖体结合位点）对代谢通量进行精细配平，最终锁定全局最优表达格局。
研究结果
该研究获得了一组令人瞩目的核心数据，系统揭示了EPS合成的多层次调控规律。
**关键发现一：前体供给是首要限速瓶颈**
单独上调*galU*（CRISPRa）能使EPS产量相比野生型提高42%，而共上调*galU*和*galE*则进一步将产量增幅推至68%。相反，CRISPRi抑制糖酵解旁路基因*pfk*（磷酸果糖激酶）可减少碳流分流，使EPS产量提升25%。这表明前体供应通量是控制EPS合成的首要靶点，而将激活与抑制策略结合，能够更高效地将碳代谢流导向EPS合成方向。
**关键发现二：重复单元聚合酶活性须精细平衡**
单独抑制*epsE*导致EPS急剧下降，证实其是合成链延伸的限速酶。然而，出乎意料的是，中等强度上调*epsE*仅使EPS产量增加19%，而高强度过表达反而导致产量下降35%，并伴随菌株絮凝和生长抑制。动力学分析揭示，过量的起始糖基转移酶会消耗大量糖核苷酸前体，形成短链寡糖并锚定在细胞膜上，阻碍细胞分裂。这为多靶点间的剂量平衡提供了重要警示。
**关键发现三：抑制负调控因子释放全局增产潜力**
通过CRISPRi弱化转录抑制因子*epsR*的表达，单独处理即可使EPS产量提升31%，且不影响菌体生长。将*epsR*抑制与*galU*-*galE*激活联合后，产量攀升至野生型的2.4倍。转录组分析显示，*epsR*下调解除了对*eps*基因簇的整体压制，其效应与增加前体供应形成“推拉协同”，产生了近加和的增产效应。
**全局最优组合与产物定向调控**
经多轮迭代优化，三模块并行调控的工程菌EPS-opt3在5 L发酵罐中EPS产量达到418 mg/L，是野生型的3.3倍，且菌体生长速率和最高密度未受明显影响。更为精妙的是，通过改变靶向糖基转移酶基因（如*epsH*和*epsI*）的sgRNA表达强度比，研究者还实现了EPS单糖组成的重编程。例如，上调*epsH*（负责半乳糖残基添加）后，EPS中半乳糖摩尔比例从32%提升至47%，分子量则由200 kDa增大至310 kDa；而抑制*epsI*则可降低鼠李糖占比，获得结构相对均一的类葡聚糖产物。这表明CRISPR/dCas9系统不仅能控制产量，还能重塑EPS的化学指纹图谱，为“定制化”多糖生产开辟了道路。
讨论与展望
这项工作首次在食品级嗜热链球菌中实现了基于CRISPR/dCas9的多基因代谢途径系统优化，其方法学意义远超EPS合成本身。与传统依赖基因敲除或质粒过表达的手段相比，该技术具有无痕、可逆与可精细调谐三大优势。通过调整sgRNA的表达水平，就能在不改变基因组序列的前提下实现对基因表达的模拟梯度调控，为代谢通路的理性配平提供了前所未有的灵活性。特别是研究中发现的*epsE*过量所导致的“代谢毒性”问题，充分说明了精细平衡在多酶途径工程中的必要性，也凸显了可调工具的强大之处。
从应用前景看，高产EPS且结构可定制的嗜热链球菌可直接作为酸奶和奶酪的发酵剂，在提升产品黏稠度和持水性的同时，实现减糖或少添加的清洁标签目标。此外，定向改造得到的特定结构EPS可被开发为益生元或免疫调节剂，推动乳制品从“营养载体”向“功能食品”的跃迁。
然而，该技术要走向工业发酵还需克服若干挑战。首先，dCas9蛋白的持续表达可能造成代谢负担，未来可采用诱导型启动子或正交降解标签控制系统以降低负荷。其次，当前多sgRNA共表达主要依赖串联质粒，其遗传稳定性在工业连续传代条件下仍需验证，基因组整合型表达元件或许是更安全的替代方案。最后，EPS产量虽已大幅提升，但仍与透明质酸等商业化多糖的发酵水平存在差距，需要结合代谢组学和蛋白质工程进一步挖掘新型限速靶点，甚至引入异源合成路径。可以预见，随着合成生物学工具的不断迭代，嗜热链球菌这一古老发酵剂的代谢潜力将被充分释放，为乳品工业的绿色智造注入全新动力。
参考来源
Linghui Kong, Z. Xiong, Xin Song, Yongjun Xia, Lian-zhong Ai. CRISPR/dCas9-based metabolic pathway engineering for the systematic optimization of exopolysaccharide biosynthesis in *Streptococcus thermophilus*. *Journal of Dairy Science*, DOI: 10.3168/jds.2021-21409.
DOI: 10.3168/jds.2021-21409