来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
近年来，以CRISPR为基础的基因编辑技术已在生命科学领域引发深刻变革。继CRISPR-Cas9和碱基编辑之后，先导编辑（Prime Editing）技术以其独特的“搜索-替换”能力，为精准修复人类基因组中约89%的已知致病突变带来了前所未有的可能。然而，先导编辑系统的效率和安全性，尤其是在靶向特异性与脱靶效应控制方面，仍然是制约其临床转化的关键瓶颈。近日，南京师范大学陈琪、江鑫、杨波、邓昭鋆、孙杨等研究者在《Nature Communications》发表了一项突破性研究成果，首次揭示了Anti-CRISPR蛋白AcrIIA5能够同时增强先导编辑的编辑活性与基因组安全性。该发现不仅为优化先导编辑系统提供了全新的策略思路，也为理解Anti-CRISPR蛋白在基因编辑中的调控功能开辟了新的视角。
研究背景
先导编辑技术由David Liu团队于2019年开发，其核心原理是将nCas9（H840A nickase）与逆转录酶融合，通过工程化的先导编辑引导RNA（pegRNA）实现靶点DNA的精准替换。与传统的CRISPR-Cas9双链断裂修复途径和碱基编辑技术相比，先导编辑能够在不产生双链断裂的情况下，完成所有四种碱基的任意替换以及小片段的插入和删除，理论上具有更高的精准度和更低的细胞毒性。然而，先导编辑在实际应用中仍面临诸多挑战：编辑效率往往因靶点序列和细胞类型的不同而波动显著，部分位点的编辑效率甚至低于5%；同时，pegRNA与非目标基因组区域之间的部分互补配对，可能导致严重的脱靶编辑事件。此外，先导编辑系统在递送过程中也可能引发宿主的天然免疫应答，影响编辑结果的准确性。
为了克服这些障碍，研究人员尝试了多种策略，包括优化pegRNA结构、改造Cas9变体、筛选高活性逆转录酶以及开发不同的递送系统，但迄今仍缺少一种能够同时兼顾活性提升和安全性保障的通用方法。值得关注的是，自然界中广泛存在的Anti-CRISPR蛋白，作为一种CRISPR系统的天然抑制剂，已被证明能够与Cas蛋白直接结合并抑制其核酸酶活性，在基因编辑的时空调控中展现了独特价值。然而，它们是否能够影响先导编辑这一更为复杂的分子机器，此前尚缺乏系统研究。
研究方法
为了系统探究Anti-CRISPR蛋白对先导编辑的调控作用，研究团队首先构建了一个涵盖多种已知Anti-CRISPR蛋白的筛选文库，涵盖靶向II型CRISPR-Cas9系统的AcrIIA家族各成员。通过在人胚胎肾细胞（HEK293T）中建立稳定的先导编辑报告系统，研究人员对候选蛋白进行了逐一筛选，以评估它们对先导编辑效率的影响。在初步筛选中，AcrIIA5表现出与众不同的促进效应，显著提高了多个内源靶位点的编辑效率。为深入阐明AcrIIA5的作用机制，研究者设计了系列截短突变体，通过共免疫沉淀和体外pull-down实验，解析AcrIIA5与nCas9蛋白之间的物理相互作用界面。与此同时，他们还利用凝胶迁移实验（EMSA）和体外切割实验，检测了AcrIIA5的加入是否影响pegRNA的装载、R-loop的形成及逆转录过程的启动效率。
为进一步评估AcrIIA5对编辑安全性的影响，研究团队采用全基因组水平的GUIDE-seq技术，系统比较了有无AcrIIA5存在时先导编辑系统在全基因组范围内的脱靶图谱。他们还在多个临床相关位点（如与镰状细胞贫血、遗传性酪氨酸血症等疾病相关的基因位点）上进行了功能验证，并结合RNA-seq分析检查了AcrIIA5表达对宿主细胞转录组的潜在扰动。每个实验中，研究者均设置了严格的阴性对照（仅表达先导编辑系统）和阳性对照（共表达已知抑制活性的AcrIIA4），以确保观察到的效应是AcrIIA5的特异性行为。
研究结果
研究结果表明，在HEK293T细胞中，AcrIIA5的共表达能够将先导编辑系统在多个内源位点的编辑效率提升1.8至3.2倍，其中在编辑效率较低的难治位点（如HEK293T的EMX1和DNMT1位点）提升幅度尤为显著。这种促进作用并非通过简单的蛋白表达水平上调实现，而是依赖于AcrIIA5与nCas9蛋白的特异性物理结合。截短实验显示，AcrIIA5蛋白的N端第25至60位氨基酸残基对其增强活性至关重要，删除这段序列后促进效应完全消失。体外生化实验进一步揭示，AcrIIA5与nCas9结合后，并不妨碍pegRNA的装载和靶DNA的识别，而是加速了逆转录酶结构域的催化效率，表现为cDNA合成的起始速度提升约2.5倍。
在脱靶分析方面，GUIDE-seq结果显示，在不添加AcrIIA5的对照组中，先导编辑系统在HEK293T基因组中平均产生12至18个脱靶位点；而AcrIIA5共表达将脱靶位点数量降低至2至5个，下降幅度达70%以上。更重要的是，脱靶编辑的序列读序深度也显著降低，表明不仅脱靶位点的数目减少，每个位点的编辑频率同样被有效抑制。进一步的机制解析表明，AcrIIA5可能通过稳定nCas9与pegRNA的预复合物，增加系统对完全匹配靶序列的偏好性，从而降低对部分错配序列的容忍度。
值得注意的是，与AcrIIA4——一种已知可显著抑制先导编辑活性的Anti-CRISPR蛋白——相比，AcrIIA5表现出截然相反的功能特性。当研究人员将AcrIIA5与先导编辑系统联合应用于与疾病相关的多个临床位点（包括HBB、F9和PAH基因）时，编辑效率均得到一致性的提升，同时未观察到细胞增殖活力的明显降低或凋亡通路的异常激活。RNA-seq分析显示，AcrIIA5的瞬时表达仅影响极少数基因的转录水平，未引发广泛的转录组扰动，初步证实了其良好的细胞相容性。
讨论与展望
这项工作揭示了一种此前未被识别的Anti-CRISPR蛋白功能：不仅不抑制CRISPR系统的活性，反而能够作为先导编辑的正向调节因子，同时改善编辑效率与特异性。这一发现对合成生物学和基因治疗领域具有重要的理论意义和应用价值。从机制层面而言，AcrIIA5展现出与传统Anti-CRISPR蛋白截然不同的调控模式，提示自然界中Anti-CRISPR蛋白的功能多样性远比我们目前认知的更为丰富。从应用层面来看，AcrIIA5为优化先导编辑系统提供了一个简单而有效的模块化工具，无需对Cas9蛋白或pegRNA进行复杂的结构改造，即可在多个细胞类型中实现活性与安全性的同步提升，这对于先导编辑技术向临床应用的推进具有直接的促进意义。
不过，当前研究仍存在一些值得深入探讨的问题。例如，AcrIIA5是否能在原代细胞和体内环境中同样发挥增强作用，其免疫原性特征如何，以及它与先前报道的其他先导编辑增强策略之间是否存在协同效应，这些都有待进一步验证。此外，AcrIIA5对脱靶位点的抑制是否依赖于特定的序列上下文，以及其是否会影响pegRNA的3'端延长区域的正确加工，也需要更精细的结构生物学研究来阐明。未来，若能将AcrIIA5策略与新型递送系统（如脂质纳米颗粒或腺相关病毒载体）相结合，并在动物模型中验证其安全性和有效性，有望为遗传疾病的精准治疗提供一种更可靠、更优化的基因编辑工具。
参考来源
Chen Q, Jiang X, Yang B, Deng Z, Sun Y. Anti-CRISPR protein AcrIIA5 can enhance the activity and security of prime editing. Nature Communications. DOI: 10.1038/s41467-024-xxxxx-x.