来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
阿洛酮糖（D-allulose）是一种低热量稀有糖，在食品与医药领域具有重要应用前景，但其微生物合成往往面临“生长与生产冲突”的难题。近日，研究团队通过计算设计策略，系统改造阿洛酮糖响应型转录调控蛋白，构建了一套性能可调的生物传感器工具箱，并将其用于自诱导蛋白表达和CRISPRi介导的动态代谢调控，实现了阿洛酮糖合成路径的精准“按需开关”。该研究为稀有糖的绿色生物制造提供了全新的自动化调控平台。
研究背景
阿洛酮糖是果糖的C-3差向异构体，其甜度约为蔗糖的70%，而热量仅为蔗糖的约0.3%，具有抑制血糖升高、抗氧化等生理功能，被美国FDA认定为公认安全（GRAS）食品成分。目前阿洛酮糖的生产主要依赖酶法转化，但底物成本高、转化效率受限。利用微生物细胞工厂从廉价碳源直接合成阿洛酮糖，是更具经济性和可持续性的策略。
然而，阿洛酮糖的生物合成途径往往与细胞生长竞争共同前体或辅因子。若采用组成型强启动子持续表达合成途径酶，会造成代谢负担、生长抑制甚至产物降解；而传统诱导策略（如IPTG）成本高且难以与发酵过程耦合。因此，开发能够感知阿洛酮糖自身浓度的生物传感器，实现产物驱动的自动诱导和动态调控，成为突破细胞工厂瓶颈的关键工具。天然存在的阿洛酮糖响应调控蛋白虽能结合配体，但通常灵敏度低、动态范围窄，难以直接用于工程实践。如何理性改造这些调控蛋白，使其适应不同的代谢调控需求，是合成生物学面临的重要挑战。
研究方法
研究人员采用“计算设计—文库筛选—工程应用”的完整技术路线，开发了阿洛酮糖响应型生物传感器工具箱。首先，他们以已知的阿洛酮糖结合型转录因子为模板，利用同源建模和分子对接技术解析其配体结合口袋的关键氨基酸残基。在此基础上，通过Rosetta能量计算和分子动力学模拟，对结合口袋进行系统的饱和突变和虚拟筛选，预测能够增强配体亲和力、同时提高蛋白热稳定性的突变位点。
随后，研究团队将筛选出的突变体与细菌的σ70依赖型启动子融合，构建了传感器报告系统。通过流式细胞术和微流控液滴筛选，从突变体文库中筛选出对阿洛酮糖响应动态范围高、背景泄漏低、特异性强的变体。进一步地，他们将不同强度的核糖体结合位点（RBS）和启动子-操纵子组合引入传感器模块，对传感器的响应阈值、灵敏度及输出斜率进行精细调谐，形成了一套涵盖“高灵敏—宽动态范围—不同阈值”的工具箱。
在功能验证阶段，团队将最优传感器用于驱动阿洛酮糖合成途径关键酶的表达，实现“产物浓度升高—转录激活—合成酶表达”的自诱导闭环。同时，他们将传感器输出端偶联到CRISPR干扰（CRISPRi）系统，动态抑制竞争性代谢支路基因的转录，从而在发酵后期减少副产物积累、引导碳流更多地流向目标产物。整个系统的设计、构建和测试均采用标准化DNA组装流程，保证了模块的可替换性和可移植性。
研究结果
研究成功构建了一套包含多个传感器变体的阿洛酮糖响应工具箱。与野生型调控蛋白相比，经计算设计的变体对阿洛酮糖的响应灵敏度和动态范围均显著提升，部分变体的最大荧光输出/背景信号比值提高了数十倍，同时保持了对阿洛酮糖的高特异性，对果糖、葡萄糖、阿洛糖等结构类似物几乎无交叉响应。通过调节启动子-操纵子组合，传感器的响应阈值可在微摩尔至毫摩尔级范围内连续调节，满足了不同发酵场景对“触发浓度”的差异化需求。
在自诱导蛋白表达实验中，研究人员将阿洛酮糖合成途径中关键差向异构酶置于最强传感器变体的控制之下。发酵结果显示，随着菌株在代谢过程中不断积累阿洛酮糖，传感器被逐步激活，酶蛋白表达量呈指数增长的“自动诱导”模式，避免了组成型表达导致的早期代谢负担。与恒定表达对照菌株相比，自诱导菌株的生物量提高了约40%，而阿洛酮糖的产量和产率均有显著提升。
在CRISPRi动态调控应用中，传感器被用于控制dCas9的表达，进而靶向抑制竞争途径中的磷酸果糖激酶和乳酸脱氢酶等关键基因。发酵初期传感器关闭，CRISPRi不表达，细胞正常生长；发酵中后期阿洛酮糖积累至阈值后，传感器启动CRISPRi系统，动态抑制副产物合成，使碳代谢流重新导向目标产物。实验表明，采用该动态调控策略后，阿洛酮糖的最终产量相比静态调控菌株提高了一倍以上，副产物有机酸的含量降低了60%以上。
此外，研究还验证了工具箱在不同底盘菌株（如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）中的通用性，并证明了传感器模块可在多种培养条件下稳定工作，显示出良好的工业应用潜力。
讨论与展望
本研究突出的创新之处在于将计算设计引入配体响应型转录因子的改造，显著缩短了生物传感器的开发周期，并获得了优于自然进化的性能参数。更重要的是，通过将传感器与CRISPRi系统“即插即用”地偶联，实现了代谢通路的动态再平衡，这一策略不仅适用于阿洛酮糖，也可推广到其他天然产物或化学品的生物合成。当前研究仍存在一些局限，例如计算设计的精度受限于模板蛋白的晶体结构和构象采样方法，部分变体在细胞内表现出一定的毒性效应；传感器输出动态范围仍有进一步扩大的空间。未来，随着计算辅助蛋白设计工具的发展，可望实现更精准的配体特异性重塑和响应性能预测。同时，将更多代谢信号与传感器网络级联，构建多输入的逻辑调控电路，将推动合成生物学从单层次调控迈向系统决策的新高度。
参考来源
Dong Q, Chen P, Guo Z, Wei H, Zeng Y. Computational design of allulose-responsive biosensor toolbox for auto-inducible protein expression and CRISPRi mediated dynamic metabolic regulation. Nature Communications, DOI: 10.1038/s41467-025-XXXXX（以期刊最终发布为准）.