来源：mSphere | 编译：DNA Lab Space
导语
烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是侵袭性曲霉病的主要病原体，其耐药性日趋严重。长链非编码RNA（lncRNA）在真菌致病调控中的作用长期未获阐明。本研究首次鉴定并证实lncRNA afu-254 参与烟曲霉的氧化应激应答、细胞壁完整性维持、唑类药物敏感性及毒力，为理解真菌lncRNA的生物学功能提供了全新视角，也为抗真菌药物靶点开发奠定了基础。
研究背景
烟曲霉是一种广泛存在于环境中的机会性致病真菌，可引发免疫功能低下患者致命的侵袭性肺曲霉病。全球每年因侵袭性曲霉病导致的死亡人数超过数十万，病死率高达30%–95%。唑类抗真菌药物是临床治疗的一线选择，但耐药菌株的不断出现使得治疗面临严峻挑战。因此，深入解析烟曲霉的应激适应与致病机制，寻找新的药物干预靶点，具有重要的临床意义。
近年来，长链非编码RNA（lncRNA）在真核生物基因表达调控中的作用受到广泛关注。在哺乳动物中，lncRNA已被证明参与染色质重塑、转录调控、mRNA稳定性调节及信号转导等多种生物学过程。然而，在丝状真菌中，lncRNA的功能研究仍处于起步阶段。烟曲霉基因组中存在大量未被注释的lncRNA转录本，但绝大多数缺乏功能验证。其中，afu-254 是一个此前从未被研究过的lncRNA，其是否参与烟曲霉的应激响应与致病过程，尚属空白。本研究正是针对这一未知领域展开系统探索，旨在阐明 afu-254 在烟曲霉生物学中的功能角色。
研究方法
研究人员首先通过生物信息学分析，在烟曲霉基因组中筛选出候选lncRNA afu-254，并利用链特异性RT-PCR确认其转录本存在及序列特征。为研究该lncRNA的功能，研究团队采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了 afu-254 缺失突变株（Δafu-254），同时通过回补实验在缺失突变株中重新表达 afu-254，获得回补菌株（Δafu-254::afu-254）。
随后，研究者开展了一系列表型分析。在应激敏感性实验中，将野生型、Δafu-254及回补菌株分别接种于含有不同胁迫因子的培养基中，包括氧化应激诱导剂（过氧化氢、甲萘醌）、细胞壁干扰剂（刚果红、钙荧光白）、唑类药物（伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑），以及高盐、高温等环境应激条件，通过测量菌落直径和生长速率量化表型差异。
在毒力评估方面，研究人员采用大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫感染模型。将各菌株孢子悬液注射入幼虫体内，记录72小时内的存活曲线，比较不同菌株的致死能力。此外，为研究 afu-254 的分子调控机制，研究者利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测了 afu-254 缺失后一系列与应激应答相关基因的表达变化，包括转录因子（如 atfA、msnA）、细胞壁合成相关基因（如 fksA、chsG）以及药物外排泵基因（如 cdr1B、srtA）的表达水平，从而探究 afu-254 可能参与的下游调控网络。
研究结果
研究结果显示，afu-254 是一个长度约2.3 kb的lncRNA，在烟曲霉菌丝阶段表达量较高。敲除 afu-254 后，突变株在正常培养条件下生长速率与野生型无明显差异，但在应激条件下表现出显著的表型缺陷。
在氧化应激方面，Δafu-254 菌株在含有8 mM 过氧化氢或0.05% 甲萘醌的培养基上生长明显受抑，菌落直径较野生型缩小约40%–60%，表明 afu-254 对于烟曲霉抵抗氧化损伤至关重要。在细胞壁应激方面，Δafu-254 对刚果红和钙荧光白的敏感性显著增强，在含0.5 mg/mL 刚果红的平板上几乎无法形成正常菌落，提示该lncRNA参与细胞壁完整性信号通路的调控。
在唑类药物敏感性测试中，Δafu-254 菌株对伏立康唑、伊曲康唑和泊沙康唑的最低抑菌浓度（MIC）较野生型显著降低。例如，野生型对伏立康唑的MIC为0.5 μg/mL，而Δafu-254 的MIC降至0.125 μg/mL，表明 afu-254 缺失导致真菌对唑类药物更为敏感。回补 afu-254 表达后，上述应激敏感性和药物敏感性均恢复至野生型水平，证实这些表型确实由 afu-254 缺失引起。
在大蜡螟感染模型中，注射野生型孢子后幼虫的半数存活时间约为48小时，而注射Δafu-254 孢子的幼虫在72小时内存活率仍高于80%，显示 afu-254 缺失菌株的毒力显著减弱。回补菌株的毒力则恢复至与野生型相近的水平。
分子机制方面，qRT-PCR分析显示，在Δafu-254 菌株中，氧化应激转录因子 atfA 的基线表达水平下降了约3倍，细胞壁合成关键基因 fksA 和 chsG 的表达也显著下调。此外，唑类药物外排泵基因 cdr1B 的表达在afu-254缺失后降低，而 srtA 的表达无明显变化。这些结果表明 afu-254 可能通过调控多个下游应激相关基因的表达，从而参与烟曲霉的应激适应和耐药性调节。
讨论与展望
本研究首次揭示了lncRNA afu-254 在烟曲霉中的多重生物学功能，证明其不仅是氧化应激和细胞壁应激应答的正向调节因子，还通过影响药物外排泵基因表达来调节唑类药物敏感性，并最终影响真菌的致病力。这一发现将lncRNA纳入烟曲霉应激调控网络的视野，拓展了对真菌非编码RNA功能的认识。
值得注意的是，afu-254 缺失并未导致正常条件下的生长缺陷，但在应激条件下展现出显著表型，提示该lncRNA可能作为“应激响应开关”发挥作用。其调控机制可能涉及与转录因子或染色质重塑复合物的互作，但本研究尚未阐明 afu-254 直接结合的分子靶点，这是未来研究的重要方向。此外，由于 afu-254 在人类基因组中不存在同源序列，它可能成为具有高度选择性的抗真菌药物研发靶点。通过小分子RNA干扰或反义寡核苷酸策略靶向 afu-254，或许能够增强唑类药物对烟曲霉的杀伤效力。后续研究还应利用RNA pull-down、CLIP-seq等技术解析 afu-254 的分子互作网络，并在哺乳动物感染模型中进一步评估其作为治疗靶点的可行性。
参考来源
Devkota R, Poudyal NR, Reyes Servin J, Lenz J, Shepardson KM. A long non-coding RNA, afu-254, is required for the oxidative stress response, cell wall stress response, azole susceptibility, and virulence in Aspergillus fumigatus. mSphere. DOI: 10.1128/msphere.00928-24.