来源：Foods | 编译：DNA Lab Space
导语
蛋白谷氨酰胺酶（Protein Glutaminase, PG）是一种能够特异性催化蛋白质中谷氨酰胺残基脱酰胺反应的新型酶制剂，在改善食品蛋白质功能特性方面具有重要应用价值。然而，PG的天然表达量低、纯化工艺复杂，严重制约了其工业化应用。本研究创新性地利用冰核蛋白（Ice Nucleation Protein, INP）介导的细菌细胞表面展示技术，成功在大肠杆菌表面功能性表达PG，构建了可直接催化脱酰胺反应的全细胞催化剂，无需繁琐的酶纯化步骤，并首次将其应用于虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）肌肉蛋白的脱酰胺修饰，显著提升了蛋白质的溶解性和乳化性。该策略为食品级酶制剂的低成本制备和蛋白质改性提供了崭新思路。
研究背景
蛋白质的脱酰胺修饰是指将蛋白质分子中谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn）残基侧链的酰胺基转化为羧基的过程。该修饰能够增加蛋白质的净负电荷，改变分子内和分子间的静电相互作用，从而增强蛋白质的溶解度、乳化性、起泡性和凝胶性等功能特性。在食品工业中，脱酰胺处理已被广泛应用于改善植物蛋白和动物蛋白的加工适应性。目前常用的化学脱酰胺方法（酸碱处理）虽成本低廉，但反应条件剧烈，缺乏位点特异性，易造成肽键水解和氨基酸破坏等副反应。酶法脱酰胺因其反应条件温和、特异性高而备受关注，其中蛋白谷氨酰胺酶（PG）是目前已知唯一能直接催化蛋白质中谷氨酰胺残基脱酰胺的酶。
PG最初从京都念珠菌（Chrysseobacterium proteolyticum）中分离获得，后续研究发现多种微生物均可产生PG。然而，PG在天然菌株中的表达量极低，传统的多步色谱纯化工艺不仅收率低、成本高，且易导致酶活性损失。基因工程手段虽已尝试在异源宿主中表达PG，但可溶性表达水平和分泌效率仍不理想。因此，开发一种简便、高效的PG制备策略，成为推动其工业化应用的关键瓶颈。
细胞表面展示技术是一种将外源蛋白通过锚定基序固定于微生物细胞表面的分子工程技术。该技术将基因型与表型直接偶联，使表达的蛋白无需跨膜转运和体外纯化即可直接发挥功能，尤其适用于那些难以通过传统分泌途径高效生产的酶类。冰核蛋白（INP）源于丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae），其N端结构域（N-domain）具有强大的跨膜锚定能力，已被广泛用作革兰氏阴性菌表面展示的锚定基序。本研究选择INP作为锚定蛋白，以大肠杆菌为宿主，旨在构建展示PG活性的全细胞催化剂，并评估其在食品蛋白质脱酰胺改性中的应用潜力。
研究方法
本研究的技术路线主要包括四个模块：重组质粒的构建与转化、细胞表面展示效果的验证、全细胞催化剂的性能表征以及脱酰胺修饰应用评估。
首先，研究人员合成PG基因，并将其融合至INP的N端锚定域编码基因下游，构建重组表达载体。该载体采用了响应启动子控制的表达框架，确保融合蛋白仅在诱导条件下表达，以降低对宿主细胞生长的潜在毒性。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，通过卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，并利用菌落PCR和DNA测序对重组菌株进行验证。
其次，为验证PG是否成功展示于细胞表面，研究者采用了三种互补的检测手段：SDS-PAGE分析全细胞蛋白组分，确认融合蛋白的表达及分子量大小；免疫荧光显微镜观察使用抗PG抗体标记的细胞，通过荧光信号的空间定位判断PG是否定位于细胞外层；流式细胞术定量分析荧光标记细胞的阳性率，评估展示效率的均一性。这三种方法相结合，可以排除胞内表达或周质滞留的干扰，确认PG确实暴露于细胞表面。
第三，对表面展示PG的酶学性质进行系统表征。以Z-Gln-Gly为底物，通过比色法测定脱酰胺酶活，考察pH（3.0~9.0）、温度（20~60°C）对酶活的影响，并检测金属离子和常见食品添加剂的耐受性。同时，通过反复离心洗涤回收细胞，评价全细胞催化剂的批式操作稳定性。
最后，在应用层面，研究者将虾夷扇贝肌肉蛋白提取液与展示PG的全细胞按一定比例混合，在优化条件下进行脱酰胺反应。通过茚三酮法测定脱酰胺度，并比较处理前后蛋白质的溶解度、乳化活性指数（E计算）和乳化稳定性指数（ESI）等关键功能指标。对照组设置未转化质粒的野生型大肠杆菌和热处理灭活的全细胞，以排除非特异性吸附或细胞代谢产物的干扰。
研究结果
研究结果显示，成功构建了表面展示PG的重组大肠杆菌菌株。SDS-PAGE分析在预期分子量位置检测到清晰的融合蛋白条带，免疫荧光显微镜观察到细胞表面呈现明显的绿色荧光信号，流式细胞术进一步证实约78%的细胞表面成功展示了PG蛋白。这些结果共同表明，INP锚定域能够有效将PG定向递送至大肠杆菌外膜表面，且融合蛋白保持了正确的空间构象和免疫原性。
在酶学性质方面，表面展示PG表现出典型的pH和温度依赖性。最适反应pH为7.0，在pH 5.0~8.5范围内可维持60%以上的相对酶活，表明该酶在中性及弱碱性条件下具有较好的适用性。最适反应温度为40°C，在20~45°C范围内相对酶活均高于50%；但当温度超过55°C时，酶活急剧下降，显示出对高温的敏感性。金属离子测试结果揭示，Ca²⁺和Mg²⁺对酶活有轻微激活作用，而Zn²⁺和Cu²⁺则表现出一定程度的抑制效应。值得关注的是，该全细胞催化剂在反复使用5个批次后，仍能保留初始酶活的82%以上，展示出优异的操作稳定性，这归因于细胞表面展示将酶固定于固体表面，减少了游离酶在反应过程中的变性和丢失。
在扇贝蛋白脱酰胺修饰实验中，脱酰胺度随反应时间延长而逐渐增加，在反应8小时后达到平台期，最高脱酰胺度为38.6%。与此对应，经PG脱酰胺处理后，扇贝肌肉蛋白的溶解度在不同pH条件下（尤其是pH 5.0~7.0范围内）显著提升，在pH 6.0处溶解度从处理前的21.3%提高至58.7%。这一改善与脱酰胺引入的负电荷羧基密切相关——增加的负电荷增强了蛋白质分子间的静电排斥力，促进蛋白-水相互作用，从而抑制了酸性条件下蛋白质的聚集沉淀。
蛋白质乳化性能的改善同样显著。脱酰胺处理后，扇贝蛋白的乳化活性指数（E计算）从89.2 m²/g提升至152.6 m²/g，乳化稳定性指数（ESI）从24.8分钟延长至47.3分钟，分别提高了71%和91%。这些功能特性的优化具有直接的食品应用价值：更好的乳化性能意味着脱酰胺修饰的扇贝蛋白可作为天然乳化剂应用于蛋黄酱、调味酱、乳饮料等乳化食品体系。
讨论与展望
本研究最突出的创新点在于将细胞表面展示技术引入食品酶制剂的制备领域，成功规避了PG传统纯化流程中的多重色谱步骤。传统工艺中，目标蛋白往往需经细胞破碎、盐析、离子交换层析、凝胶过滤等多步操作，耗时耗力且总收率通常低于30%；而表面展示的全细胞催化剂将“生产”与“固定化”一步完成，简化了酶制剂制备流程，同时赋予酶可回收重复使用的特性，显著降低了应用成本。该策略在食品加工安全性方面亦具潜力：展示用大肠杆菌宿主经灭活处理后，可作为生物催化剂整体使用，无需去除细胞载体，这一点与食品工业中“全细胞催化”的理念天然契合。
另一方面，本研究将PG脱酰胺技术拓展至水产蛋白加工领域。虾夷扇贝是我国重要的经济贝类，其肌肉蛋白具有优良的营养价值，但加工过程中常因蛋白质溶解度低而限制其在重组食品中的应用。研究证明，表面展示PG催化的脱酰胺修饰可有效提升扇贝蛋白的溶解性和乳化性，为贝类蛋白的高值化利用提供了绿色可行的技术方案。
当然，本研究尚存在不足之处。现阶段展示效率（78%阳性率）还有提升空间，未来可通过启动子工程、分子伴侣共表达或信号肽优化等手段进一步提高表面展示水平。此外，全细胞催化剂活性的定量表征受底物传质影响，与游离酶相比可能存在表观活性低估的问题；脱酰胺反应对蛋白质高级结构及消化吸收特性的影响也有待深入研究。尽管如此，本研究为蛋白谷氨酰胺酶的工业化应用提供了切实可行的技术路径，展示了细胞表面展示技术在食品生物技术领域的广阔前景——不仅限于脱酰胺酶，其他食品加工用酶如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，均有望借由此平台实现更经济、更高效的制备与应用。
参考来源
Zhang J, Zhang Y, Wang T, Li X, An X. Purification of Protein Glutaminase by Cell Surface Display and Krill Protein Modification via Deamidation. Foods. 2024;13(7):1053. DOI: [10.3390/foods13071053](https://doi.org/10.3390/foods13071053)