来源：Protein Sci | 编译：DNA Lab Space
微生物耐药性和生物被膜感染已成为全球公共卫生领域的重大挑战，传统的抗菌策略亟需革新。群体感应淬灭酶可特异性降解细菌信号分子N-酰基高丝氨酸内酯（AHL），从而在不直接杀灭病原菌的前提下干扰其致病行为。本研究从植物内生真菌Aspergillus pseudonomiae中挖掘并表征了一种全新的稳定内酯酶，该酶不仅具有广谱的AHL水解活性，还表现出优异的抗菌和抗真菌性能，为开发新型抗感染制剂和生物被膜控制工具提供了有潜力的酶学元件。
研究背景
许多革兰氏阴性病原菌依赖群体感应系统调节毒力因子表达和生物被膜形成，而AHL是其中最重要的信号分子。通过酶促降解AHL实现群体感应淬灭，已发展成为一种极具吸引力的抗感染策略。内酯酶（lactonase）能够催化AHL内酯环的水解开环，使其失去信号传导功能，从而抑制病原菌的致病行为。目前已报道的AHL内酯酶主要来源于细菌，它们往往在稳定性、底物谱或表达可溶性方面存在局限，限制了实际应用。内生真菌是指生活在健康植物组织内部而不引起病害的真菌，其代谢酶系丰富多样，但作为群体感应淬灭酶的来源尚未被充分开发。Aspergillus pseudonomiae是一种近年来被鉴定的内生曲霉物种，其基因组和分泌组可能隐藏着具有独特催化性能的内酯酶。因此，从这一新颖微生物中挖掘并表征新型稳定内酯酶，不仅有助于拓展酶资源库，也可能为解决现有内酯酶稳定性不足的问题提供新思路。
研究方法
该研究遵循“菌株发掘—基因克隆—异源表达—生化表征—活性验证”的完整技术路线。首先，研究者从健康植物组织中分离内生真菌，通过形态学与分子鉴定确认为Aspergillus pseudonomiae。随后，利用基因组或转录组数据中的序列同源搜索，锁定一个推测的内酯酶编码基因。通过PCR扩增该基因片段，构建至带有组氨酸标签的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行异源表达。表达菌株经IPTG诱导后裂解，利用镍离子亲和层析纯化目标蛋白，再经凝胶过滤层析或透析去除杂质，获得高纯度重组酶用于后续实验。
在酶学表征层面，研究者采用对硝基苯酚酯或pH指示剂法测定内酯酶水解活性，考察了不同pH缓冲液、温度条件以及金属离子/additives对酶活力的影响。为评价其稳定性，将酶在不同温度和pH条件下孵育一定时间后测定残余活力，并评估了冻融稳定性与储存稳定性。底物特异性实验使用了不同酰基链长和修饰的AHL类似物，以明确该酶的底物谱。
抗菌和抗真菌活性的评价采用了经典的琼脂扩散法和微量肉汤稀释法。研究者选取了包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌在内的典型细菌，以及白色念珠菌等真菌菌株。为了区分杀菌作用与群体感应淬灭作用，还设计了基于紫色杆菌或绿脓杆菌的群体感应报告菌株实验，考察酶处理对信号分子降解及表型抑制的效果。此外，研究还通过扫描电镜或结晶紫染色法评估了该内酯酶对生物被膜形成的影响。
研究结果
研究成功从Aspergillus pseudonomiae中克隆并表达了目标内酯酶基因，纯化后的重组酶在SDS-PAGE上呈现单一清晰条带，分子量与理论值相符。酶学性质测定显示，该酶在中性pH附近表现出最佳催化活性，同时在较宽的pH范围内保持较高稳定性，表明其具有良好的酸碱耐受性。温度稳定性实验进一步揭示，该酶在常温及中等温度下稳定，经过长时间孵育后仍能保留大部分活力，符合“稳定化内酯酶”的特征。在底物谱方面，该酶能够水解多种不同链长和取代基的AHL底物，尤其对短中链AHL表现出较高催化效率，显示出宽泛的底物适应性。这些生化特性使得该酶在复杂环境中的应用潜力得以凸显。
在抗菌活性评价中，该内酯酶对测试的多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出抑制效果，且抑菌效果呈剂量依赖性。值得注意的是，其抗菌效应可能并非直接杀菌，而是通过降解群体感应信号分子、抑制病原菌毒力基因表达来实现。以报告菌株的实验证实，该酶能够有效降解AHL并中断群体感应通路，导致紫色杆菌素产生减少或铜绿假单胞菌毒力因子表达下调。
在抗真菌方面，该酶对白色念珠菌等真菌也展现出抑制活性，提示其作用机制可能超出了AHL降解范畴，或通过干扰真菌群体感应及形态转变相关通路实现。生物被膜实验显示，经该酶处理后，细菌生物被膜的形成量显著降低，结合结晶紫染色半定量分析，进一步说明该酶能够抑制被膜形成，进而增强病原菌对抗生素的敏感性。这些结果表明该内酯酶是一种兼具抗菌与抗真菌功能的双效酶，具有作为新型抗感染生物制剂的潜力。
讨论与展望
本研究报道的来自内生真菌Aspergillus pseudonomiae的新型内酯酶，具有显著的催化活性和优异的稳定性。与已报道的细菌源内酯酶相比，该真菌源酶在pH和温度耐受性方面展现出独特优势，这对于工业应用和体内环境