来源：AMB Express | 编译：DNA Lab Space
导语
右旋糖酐酶在制糖、医药及食品工业中具有重要应用价值，然而天然菌株酶产量低、发酵成本高的问题长期制约其产业化进程。近期发表于《AMB Express》的一项研究，创新性地将常压室温等离子体（ARTP）诱变技术应用于黑曲霉，并结合异源表达策略成功提高了右旋糖酐酶的产量与酶活性。该研究为工业酶制剂的高效制备提供了新的技术路径，具有重要的理论价值与应用前景。
研究背景
右旋糖酐酶（Dextranase，EC 3.2.1.11）是一类能够特异性水解右旋糖酐中α-1,6糖苷键的水解酶，在制糖工业中用于降解甘蔗汁中的葡聚糖以降低糖液黏度，在牙科领域作为预防龋齿的活性成分，此外在医药级右旋糖酐的生产中也扮演着关键角色。然而，右旋糖酐酶的工业化应用长期面临两大瓶颈：一是天然生产菌株如黄青霉、绳状青霉等的产酶水平普遍较低，难以满足工业化需求；二是酶的热稳定性和pH稳定性等酶学性质有待改善。
黑曲霉（Aspergillus niger）被普遍认为是安全（GRAS）的工业宿主菌，具有强大的蛋白分泌能力和完善的翻译后修饰系统，已被广泛用于多种工业酶制剂的生产。但黑曲霉内源性右旋糖酐酶的表达水平较低，单纯依赖传统诱变手段难以实现突破性提升。常压室温等离子体（ARTP）作为一种新兴的物理诱变技术，能够在大气压条件下产生高密度、高活性的等离子体射流，通过多种作用机制（包括紫外辐射、活性氧损伤、电穿孔等）对微生物基因组造成随机损伤，从而高效诱发基因突变。与传统诱变方法相比，ARTP具有操作温和、突变率高、变异谱广、环境友好等优势，已在细菌、放线菌和真菌的菌种改良中展现出巨大潜力。
基于上述背景，研究者设想是否可以将ARTP诱变技术与异源表达策略相结合，通过ARTP对黑曲霉进行全局诱变以获得高产突变菌株，再借助异源表达筛选高效酶基因，从而系统性地解决右旋糖酐酶产量不足的问题，为工业应用提供优良的酶源和菌株。
研究方法
本研究的技术路线主要分为三个有机衔接的阶段：ARTP诱变筛选、右旋糖酐酶基因的克隆与异源表达、重组酶酶学性质表征。
ARTP诱变与突变文库构建。 首先，以黑曲霉野生型菌株的分生孢子为起始材料，制备浓度约为10⁶–10⁷ CFU/mL的孢子悬液，取10 µL均匀涂布于无菌金属载片上，置于ARTP诱变仪中进行处理。处理条件设定为：功率120 W，气流量10 SLM，处理距离2 mm，照射时间分别设为0 s（对照）、30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s和210 s，以确定最佳致死率对应的诱变剂量。经不同时间处理后的孢子悬液经适当稀释后涂布于含有右旋糖酐的鉴别培养基平板上，28 °C培养72 h。通过透明圈法初步筛选具有较高右旋糖酐酶活力的突变菌株：在含有底物的平板上，右旋糖酐酶活性越强，菌落周围出现的水解透明圈直径与菌落直径的比值（HC值）越大。挑取HC比值显著高于野生型的候选菌株，经斜面纯化后，采用液体摇瓶发酵复筛，以DNS法测定发酵上清液中的右旋糖酐酶活力，最终获得遗传稳定性良好的高产突变菌株。
右旋糖酐酶基因的克隆与异源表达。 提取野生型黑曲霉的总RNA，根据已知真菌右旋糖酐酶基因的保守序列设计简并引物，通过RT-PCR扩增右旋糖酐酶编码基因的cDNA序列。目的基因经测序验证后，以限制性内切酶Nhe I和Xho I双酶切，连接到同样经双酶切处理的pPIC9K表达载体中，构建重组质粒pPIC9K-dex。重组质粒经Sac I线性化后，通过电转化法导入毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115感受态细胞中。转化子在MD平板上筛选His⁺阳性克隆，再经G418梯度浓度筛选多拷贝整合转化子。将阳性转化子接种于BMGY培养基中增殖至OD₆₀₀约2.0–6.0，离心收集菌体后转移至BMMY培养基中，每24 h补加甲醇至终浓度0.5%（v/v）以诱导表达，连续诱导96 h，定期取样分析重组蛋白表达量和酶活力。
重组酶酶学性质分析。 将诱导培养的发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析脱盐后，利用镍离子亲和层析或阴离子交换层析纯化重组右旋糖酐酶。以3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定酶活力，以葡萄糖标准曲线计算还原糖生成量。酶学性质表征包括：最适反应温度（在30–70 °C范围内测定）、最适反应pH（在pH 3.0–8.0范围内测定）、温度稳定性（在不同温度下保温1 h后测定残余酶活）和pH稳定性（在不同pH缓冲液中4 °C保温24 h后测定残余酶活），以及金属离子和化学试剂对酶活性的影响。
研究结果
ARTP诱变显著提升了黑曲霉右旋糖酐酶产量。 经过不同时间ARTP处理，孢子致死率随处理时间延长呈“先升后稳”的趋势，其中处理90 s时致死率约为85%，该条件被选为后续诱变的最佳剂量。经透明圈初筛和摇瓶复筛，共计获得12株酶活力显著提高的突变菌株，其中编号为M-7的突变株表现最优，其右旋糖酐酶活力达到野生型菌株的3.2倍，且经过连续5代传代培养后酶活力保持稳定，表明该突变株具有良好的遗传稳定性。这一结果验证了ARTP技术在黑曲霉高产菌株选育中的高效性，其多靶点诱变机制可能同时影响了右旋糖酐酶编码基因的启动子区域、分泌通路相关基因以及蛋白酶抑制因子基因等，从而实现产量的协同提升。
右旋糖酐酶基因的克隆与异源表达成功。 通过RT-PCR从黑曲霉中成功扩增获得长度约为1800 bp的右旋糖酐酶基因cDNA序列，其开放阅读框编码约600个氨基酸，N端含有信号肽序列，催化结构域属于糖苷水解酶GH49家族。该基因序列已提交至GenBank数据库（登录号另见原文）。重组质粒pPIC9K-dex经测序确认序列正确后转化毕赤酵母GS115，经G418抗性筛选挑取高拷贝转化子。在甲醇诱导条件下，重组菌株在诱导72 h时培养上清液中的右旋糖酐酶活力达到峰值，约为原始黑曲霉野生型菌株的38.5倍，比活力达到约210 U/mg。SDS-PAGE分析显示，在分子量约66 kDa处出现明显的蛋白质条带，与理论预测的右旋糖酐酶分子量相吻合，证实重组蛋白已在毕赤酵母中成功分泌表达。
重组右旋糖酐酶的酶学性质表征。 纯化后的重组酶最适反应温度为55 °C，在50–60 °C范围内能保持80%以上的酶活力；最适反应pH为5.0，在pH 4.0–6.0范围内酶活力稳定。热稳定性实验表明，该酶在50 °C保温1 h后残余酶活仍保持在85%以上，但60 °C保温1 h后残余酶活降至约40%。pH稳定性方面，酶在pH 4.0–7.0条件下4 °C保温24 h后残余酶活均在90%以上。金属离子影响实验显示，Ca²⁺对酶活性有轻微激活作用（110%），而Cu²⁺和Fe³⁺则具有较强的抑制作用（分别仅为对照的42%和55%）。此外，重组酶对分子量200 kDa的右旋糖酐底物表现出最高的催化效率。
上述结果表明，ARTP诱变能够有效提升黑曲霉内源右旋糖酐酶的产量，而将来源清晰的右旋糖酐酶基因在毕赤酵母中异源表达，则能够获得更高产量和良好酶学性质的重组酶制剂。
讨论与展望
本研究展现了ARTP诱变与异源表达两种策略各自的独特优势，并形成了一条较为完整的菌株改良技术链条。ARTP诱变操作简便、突变谱广，可在不引入外源基因的前提下获得产量显著提升的突变株，对于避免转基因生物安全争议、加速优良工业菌株培育具有实用价值；而异源表达策略则借助毕赤酵母强大的分泌表达能力和成熟的甲醇诱导调控系统，实现了右旋糖酐酶产量的跨越式提升。值得注意的是，本研究中异源表达所获得的酶产量约为ARTP突变株的12倍、野生型的38.5倍，体现了表达系统选择对酶产量巨大的影响。
然而，研究中也存在一些值得深入探讨的问题。例如，ARTP突变株M-7产量提升的分子机制尚未明确，后续可通过全基因组重测序和转录组分析揭示关键突变位点；异源表达的重组酶热稳定性仍不够理想（60 °C时明显失活），在制糖工业中通常需要高温操作，未来可通过蛋白质工程手段（如定点突变、定向进化）进一步提升酶的热稳定性。此外，重组酶的糖基化修饰模式与天然酶可能存在差异，其对酶的催化效率和体内半衰期的影响值得进一步考察。总体而言，本研究为右旋糖酐酶的工业化生产提供了有价值的候选菌株和重组酶源，也为其他工业酶制剂的菌种改良和高效表达提供了可借鉴的技术范式。
参考来源
Huang X, Yang L, Zhang W, Yang D, Guo H. Atmospheric room-temperature plasma mutagenesis and heterologous expression of dextranase in Aspergillus niger. AMB Express. 2024. DOI: 待补充.