来源：AMB Express | 编译：DNA Lab Space
右旋糖酐酶是一种专一性水解α-1,6-糖苷键的工业用酶，在制糖、食品和医药领域应用广泛，但天然菌株的产酶水平长期制约其规模化生产。Huang等人将常压室温等离子体（ARTP）诱变技术与异源表达策略相结合，以工业安全宿主黑曲霉为底盘，通过诱变筛选获得稳定高产突变株，并在此背景下成功实现右旋糖酐酶基因的异源表达，显著提升酶产量。这一工作展示了ARTP诱变与基因工程联用的潜力，为工业酶制剂的菌株改良提供了有益参考。
研究背景
右旋糖酐酶能够水解由右旋糖酐蔗糖酶合成的右旋糖酐，将其降解为低分子糖或异麦芽糖，从而有效解决制糖过程中因葡聚糖引起的过滤困难、管路堵塞和产品浑浊等问题。此外，右旋糖酐酶还可用于牙菌斑防治和临床用右旋糖酐代血浆的分子量调控，具有较高的应用价值。目前，工业化生产右旋糖酐酶主要依赖微生物发酵，但野生菌株的酶活力普遍偏低，无法满足经济性要求，因此需要构建高效表达该酶的工程菌株。
黑曲霉（Aspergillus niger）作为公认安全的工业微生物，具有优良的蛋白分泌能力和成熟的发酵工艺，是许多工业酶制剂的表达宿主。然而，将外源右旋糖酐酶基因导入黑曲霉并实现高效表达，仍面临表达量低、遗传不稳定等问题。ARTP诱变是一种新型的常压非热等离子体诱变技术，能够向微生物细胞表面均匀投射高能活性粒子，诱导DNA发生多种类型的突变，具有操作温和、突变率高、突变谱广等特点，近年来已广泛用于高产菌株的快速选育。Huang等人的研究试图将ARTP诱变获得的高产性状与异源表达技术有机结合，在黑曲霉中实现右旋糖酐酶的高水平生产。
研究方法
该研究采用“诱变育种—基因克隆—异源表达—酶学评价”的完整技术路线。首先，以黑曲霉的孢子为材料进行ARTP诱变处理。将新鲜孢子悬浮于无菌甘油保护液中，取10 μL滴加在无菌金属载片上，置于ARTP诱变仪中，设置不同辐照时间（0、30、60、90、120和150 s），通过存活率确定最适诱变剂量。诱变后的孢子用无菌水适当稀释，涂布于查氏琼脂平板，30°C培养5～7天后，挑取形态差异明显的单菌落进行摇瓶初筛和复筛，以右旋糖酐酶的活力高低筛选高产突变株，并连续传代培养考察其遗传稳定性。该流程能够得到兼具高产潜力与稳定遗传背景的优质宿主菌株，为后续异源表达奠定基础。
在异源表达部分，研究者首先从右旋糖酐酶供体微生物的基因组DNA中扩增出完整的编码基因。根据序列分析，选择去掉信号肽的成熟肽编码区域，通过重组PCR将其连接到带有黑曲霉糖化酶（glaA）强启动子和相应信号肽序列的高效表达载体中，同时加入营养缺陷型筛选标记或抗性标记。重组质粒经酶切和测序验证后，利用PEG介导的原生质体转化法导入黑曲霉突变株中。转化子经选择培养基初步筛选后，通过PCR扩增和Southern blot杂交确认外源基因的整合情况与拷贝数，最终挑取正确整合的菌株进行摇瓶发酵。
发酵实验采用优化的液体培养基，在30°C、200 r/min条件下培养7天，定期取样测定发酵液中的右旋糖酐酶活性、总胞外蛋白浓度以及菌体生物量。培养结束后，通过硫酸铵沉淀、离子交换层析等步骤对重组右旋糖酐酶进行部分纯化，并利用SDS-PAGE分析蛋白纯度与分子量。同时，对纯化酶的最适温度、最适pH、热稳定性和pH稳定性等酶学性质进行系统测定，以评价其工业化应用潜力。
研究结果
ARTP诱变处理结果显示，随着辐照时间延长，黑曲霉孢子存活率呈明显下降趋势。处理90 s时，存活率约为32%，此时正突变率较高，共获得百余株候选菌株。经过摇瓶复筛，研究者获得一株右旋糖酐酶活力相对出发菌株提高约1.9倍的突变株，并在连续传代10次后仍保持稳定的酶活水平，表明该突变性状具有较好的遗传稳定性。随后，该突变株被