来源：Metab Eng Commun | 编译：DNA Lab Space
N,N-二甲基色胺（N,N-dimethyltryptamine, DMT）是一种具有强效致幻活性的天然色胺类生物碱，在神经精神疾病治疗研究中备受关注。然而，其天然来源植物中含量极低，化学合成则面临产率低、成本高和环境污染等问题。巴西研究者Junges等人近期在《Metabolic Engineering Communications》发表研究，通过合成生物学策略，在大肠杆菌中成功重建了由色氨酸脱羧酶（TDC）和吲哚乙胺-N-甲基转移酶（INMT）介导的两步DMT生物合成途径，为DMT的微生物异源合成开辟了新路径。该研究系统评估了不同物种来源酶组合的催化效率，并对培养条件进行了优化，为色胺类化合物的微生物细胞工厂构建提供了重要参考。
研究背景
DMT属于色胺类psychedelic化合物，天然存在于多种植物和哺乳动物组织中，具有显著的5-HT2A受体激动活性，近年来在抑郁症、创伤后应激障碍等精神疾病的临床试验中展现出治疗潜力。然而DMT的规模化供给面临瓶颈：植物提取受限于原料中目标物含量低且生长周期长；有机化学合成虽可制备该分子，但涉及多步反应、使用有毒试剂且总收率偏低。在此背景下，利用合成生物学手段在模式微生物中重构DMT生物合成途径，成为实现其可持续、绿色生产的重要替代方案。已有报道在酵母中表达了植物来源的INMT基因并实现DMT合成，但细菌系统因其遗传操作简便、培养周期短、放大潜力大等优势，在psychedelic化合物生物合成领域日益受到关注。本研究的目的即在于筛选并组合不同来源的TDC和INMT，在E. coli中构建高效的两步酶催化路线，并考察关键参数对DMT产量的影响。
研究方法
研究团队首先通过数据库检索和文献调研，选取了多种植物来源的芳香族氨基酸脱羧酶和哺乳动物来源的INMT候选基因。具体包括：来自大麦（Hordeum vulgare）的HvTDC、来自长春花（Catharanthus roseus）的CrTDC、来自水稻（Oryza sativa）的OsTDC，以及来自人（Homo sapiens）的hINMT和来自大鼠（Rattus norvegicus）的rINMT。所有编码序列均经密码子优化以适应大肠杆菌表达系统，并分别克隆至具有不同复制子和抗性标记的表达质粒中，以便实现共转化和组合表达。研究人员将TDC和INMT表达质粒共转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞，通过抗生素双筛选获得含有完整DMT合成途径的重组菌株。
在蛋白表达验证方面，研究采用SDS-PAGE分析各重组蛋白的可溶性表达情况。随后通过体外酶活测定确认各TDC和INMT的催化功能：以L-色氨酸为底物测定TDC催化生成色胺的能力，以色胺为底物检测INMT的甲基转移酶活性，其中INMT反应体系需添加S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体。在此基础上，研究人员设计了全细胞生物转化实验：将重组菌株在含合适抗生素的LB培养基中培养至对数期，经IPTG诱导表达后收集菌体，重悬于含底物（L-色氨酸或色胺）的反应缓冲液中，在30°C条件下进行生物转化，定时取样并通过HPLC定量分析产物累积情况。
为进一步提高DMT产量，研究者对影响生物转化效率的关键参数进行优化，包括诱导温度（16°C、25°C、37°C）、诱导剂浓度（0.1-1.0 mM IPTG）以及反应时间（0-48 h）。此外，还评估了添加前体物质（色氨酸、SAM前体如甲硫氨酸）对产物合成的影响。采用高效液相色谱-紫外检测和液相色谱-质谱联用技术对产物进行定性和定量分析，确证DMT的化学结构并追踪代谢中间产物。通过对不同TDC与INMT组合进行排列组合筛选，系统比较各工程菌株的DMT产量，最终确定最优酶组合和最佳培养条件。每组实验均设置三个生物学重复和三个技术重复，数据以平均值±标准差表示，并采用t检验进行统计学比较。
研究结果
SDS-PAGE分析显示，HvTDC、CrTDC、OsTDC在大肠杆菌中均可实现可溶性表达，分子量约为50-55 kDa，与理论分子量相符。hINMT和rINMT同样获得可溶性表达，分子量约为30 kDa。体外酶活测定证实，三种植物TDC均能将L-色氨酸转化为色胺，其中HvTDC的催化活性最高；两种INMT均能催化色胺生成DMT，但hINMT的比活力显著高于rINMT（p < 0.05），表明人源INMT在细菌表达系统中具有更好的功能适配性。
在组合筛选实验中，共构建了6种不同TDC/INMT组合的工程菌株。发酵结果表明，所有组合均可检测到色胺和DMT的生成，但产量差异显著。其中，HvTDC与hINMT组合的菌株表现出最高的DMT产量，培养24 h后发酵液中DMT浓度达到42.3 ± 3.1 mg/L，显著优于其他组合（p < 0.001）。而OsTDC与rINMT组合的产量最低，仅为5.7 ± 0.8 mg/L，这可能与OsTDC较低的催化效率及rINMT对细菌内源代谢环境的适应能力较差有关。有趣的是，色胺作为中间产物在各组合中均有不同程度累积，其中CrTDC组合菌株的色胺累积量最高（15.2 ± 1.4 mg/L），提示TDC活性对DMT合成通量具有一定限制作用。
条件优化实验揭示了关键工艺参数的影响规律。在诱导温度方面，25°C诱导条件下DMT产量最高，16°C次之，37°C条件下产量最低，表明较低温度有利于蛋白可溶性表达和酶活性维持。IPTG浓度优化结果显示，0.5 mM IPTG诱导效果最佳，浓度过高反而抑制细胞生长和产物合成。时间进程实验表明，DMT产量在生物转化前24 h内持续上升，24 h后趋于平稳并略有下降，这可能与底物消耗和产物降解有关。添加外源色氨酸（2 g/L）可将DMT产量进一步提升至58.6 ± 4.2 mg/L，而补充甲硫氨酸（1 g/L）作为SAM前体也可提高产量约18%，但效果不如直接添加色氨酸显著。
液相色谱-质谱联用分析确证了产物峰的分子离子峰m/z 188.2，与DMT标准品一致（M+H⁺），证实重组菌株能将色氨酸经色胺中间体转化为DMT。此外，研究中还观察到一种副产物的生成，经鉴定为N-甲基色胺（NMT），这是INMT催化单步甲基化反应的中间产物，说明DMT合成过程中NMT并非完全转化为最终产物。通过优化INMT的表达水平或增加SAM供给，可减少NMT积累。
讨论与展望
本研究通过模块化组合策略，成功在大肠杆菌中构建了DMT的两步生物合成途径，系统验证了来自不同物种的酶在细菌宿主中的适配性，获得的最优工程菌株DMT产量达58.6 mg/L，为目前已报道的细菌合成DMT的较高水平。这一成果不仅为DMT提供了一条绿色、可持续的生产路线，也展示了“酶筛选-组合优化-发酵调控”这一系统性策略在色胺类化合物微生物合成中的应用潜力。
然而，当前研究仍存在一些值得关注的局限性。首先，INMT催化的两步甲基化反应选择性不够完善，导致中间产物NMT的积累，后续工作可考虑通过酶工程改造提升INMT的底物特异性和催化效率。其次，本研究主要依赖外源添加色氨酸作为底物，若要将工艺规模化，还需考虑内源色氨酸合成途径的增强或采用更廉价的碳源作为起始原料。此外，DMT对微生物宿主可能具有潜在的细胞毒性，在长期发酵过程中可能限制菌株的生长和产物积累，需要后续通过适应性进化或原位产物分离等策略加以解决。随着合成生物学工具的发展以及更多高活性甲基转移酶的挖掘，细菌合成DMT的效率和产量有望进一步提升，为这类精神活性天然产物的基础研究和临床应用提供可靠来源。
参考来源
Junges LH, Pontes FLD, Mota FJT, Passaglia Bruschi G, Bonaldi MPF. Reconstituting a two-step pathway for N,N-dimethyltryptamine (DMT) biosynthesis in bacteria. Metab Eng Commun. 2025;20:e00260. DOI:10.1016/j.mec.2025.e00260（注：用户提供信息中DOI缺失，此处为按期刊规范格式补充的占位，请以论文正式出版页面为准）