来源：FEBS Open Bio | 编译：DNA Lab Space
导语
蛋白质工程中，变体功能筛选常受限于繁琐的细胞裂解和蛋白纯化步骤，成为通量提升的主要瓶颈。捷克研究者开发了一种基于未纯化无细胞表达系统的快速筛选平台，成功用于葡萄球菌激酶（SAK）变体的功能性评估。该方法绕过了传统体内表达和纯化流程，极大缩短了从基因突变到活性验证的周期，为定向进化策略下的蛋白质工程提供了新的技术支撑。
研究背景
葡萄球菌激酶（Staphylokinase，SAK）是金黄色葡萄球菌分泌的一种纤溶酶原激活剂，能够特异性结合并激活人纤溶酶原，进而启动纤维蛋白溶解过程。凭借其高纤维蛋白特异性、低系统性出血风险以及免疫原性可通过蛋白质工程进行调节等优点，SAK已被视为治疗急性心肌梗死等血栓性疾病的重要候选药物。然而，天然SAK在临床应用中仍面临免疫原性较强、半衰期较短等问题，促使研究者不断尝试通过蛋白质工程手段对SAK进行改造。
传统的蛋白质变体筛选策略通常依赖大肠杆菌等宿主细胞的异源表达，其后需要经过细胞裂解、亲和纯化、定量校正和活性检测等多个环节。这一流程不仅耗时耗力，而且表达量的个体差异往往干扰功能比较的准确性，筛选通量严重受限。为了突破这一瓶颈，无细胞蛋白质合成系统（Cell-Free Protein Synthesis，CFPS）因其开放的反应环境、简化的操作流程以及不依赖活细胞的特点而备受关注。然而，常规CFPS系统仍需要将表达产物进行纯化后才能进行功能测定，制约了其在筛选场景中的直接应用。
本研究致力于构建一种无需纯化步骤的CFPS筛选平台，将基因表达与活性检测在同一反应体系中连续完成，从而实现对SAK变体功能的高通量评估。
研究方法
研究团队构建了一套基于大肠杆菌裂解液的无细胞表达系统，并围绕SAK变体的快速筛选进行了系统性的方法学设计与验证。
首先，在表达载体构建方面，研究者将SAK基因置于T7启动子控制之下，并在基因序列中融合了His标签以便于必要的验证性纯化分析。质粒DNA在无细胞反应体系中直接作为表达模板，省去了传统蛋白表达中质粒转化、细胞培养和诱导表达等步骤。
在无细胞表达环节，研究采用批次式（Batch Mode）反应体系，以线性化质粒DNA为模板，在大肠杆菌S30裂解液中进行体外转录和翻译偶联反应。反应体系包含氨基酸混合物、能量再生系统以及必要的辅因子。表达产物直接分泌至反应缓冲液中，无需额外的细胞裂解步骤。
为建立“表达-检测”一体化的筛选流程，研究者设计了基于纤溶酶原激活活性的功能性检测策略。SAK与纤溶酶原形成复合物后，可将纤溶酶原转化为纤溶酶，后者能够水解特异的发色底物（如S-2251），释放对硝基苯胺（pNA），在405 nm波长下产生可定量检测的光吸收信号。由于无细胞表达体系中的背景蛋白不会干扰该发色底物的特异性水解反应，因此可以在不纯化目标蛋白的情况下直接测定SAK变体的活性。
在变体库的构建方面，研究选取了SAK中与免疫原性相关的一个线性表位区域，通过定点突变技术引入多个氨基酸替换，构建了包含十余个SAK突变体的小型变体库。每个变体分别作为独立无细胞表达反应的模板，在96孔板中进行平行表达和活性检测。为验证该筛选系统的可靠性，研究还将无细胞表达系统中测得的变体活性与传统大肠杆菌表达纯化后蛋白的活性数据进行对比分析。
此外，研究者还考察了反应体系中DNA模板浓度、反应时间以及底物浓度等参数对筛选结果的影响，以保证各变体之间的比较建立在统一、优化的反应条件之上。通过SDS-PAGE和Western blot分析，确认了无细胞反应体系中目标蛋白的表达水平及其完整性。
研究结果
研究结果表明，基于未纯化CFPS的筛选策略能够有效区分不同SAK变体的功能活性差异。在优化后的反应条件下（DNA模板浓度5-10 ng/μL，反应时间3-4小时），无细胞表达体系中SAK的产量足以支撑后续的活性检测，且表达水平在不同变体之间的差异较小，排除了表达量对活性比较的系统性干扰。
在变体库的筛选过程中，研究者以野生型SAK为参照，对十余个表位突变体的纤溶酶原激活活性进行了定量比较。结果显示，大部分位于抗原表位区域的氨基酸替换不会显著影响SAK的催化活性，但个别位点的突变（例如特定带电残基的替换）会导致活性大幅下降。这一发现与SAK分子结构中该区域与功能域空间相邻的结构特征相吻合，验证了筛选结果的生物学合理性。
更为关键的是，将未纯化CFPS测得的活性数据与传统纯化蛋白样品的活性数据进行相关性分析，发现两者呈现良好的一致性（相关系数R²约为0.9）。这表明未纯化体系中的背景蛋白不会干扰SAK活性的定量评估，筛选平台可以可靠地反映变体蛋白的真实功能水平。这一验证实验的意义在于：它证明了该方法不仅能够实现“快速”，同时也保障了“准确”。
从筛选通量来看，整个流程从质粒DNA的加入到获得活性数据仅需约4～5小时，相比传统的“表达-纯化-检测”流程（通常需要2～3天），时间成本压缩了约一个数量级。同时，由于所有操作均在96孔板中进行，配合自动化移液工作站，该平台可轻松扩展到数百至数千个变体的平行筛选。
讨论与展望
该研究展示了一种极具实用价值的蛋白质变体筛选策略。其核心创新在于利用SAK活性的可分泌性和发色底物检测的特异性，实现了“无细胞表达”与“功能检测”的无缝衔接，从而避免了纯化步骤对筛选通量的制约。这一设计理念可以被推广至其他具有可溶性活性且便于进行酶学检测的蛋白质分子，如工业用酶、诊断用酶或治疗性蛋白。
然而，该方法也存在一定的局限性。首先，无细胞表达系统的成本相对较高，在大规模变体库筛选中可能面临经济性挑战。其次，并非所有目标蛋白都可以直接在粗体系中测定活性，尤其是那些需要辅助因子、跨膜转运或翻译后修饰方能表现功能的蛋白质，该方法的应用将受到限制。此外，由于未进行纯化，表达体系中内源蛋白酶的降解作用也可能干扰某些易感蛋白的稳定性和活性测定结果。
从应用前景来看，该策略与定向进化工作流程的契合度较高。将未纯化CFPS筛选与易错PCR或饱和突变等文库构建方法联用，可以实现“突变—表达—筛选”的闭环操作，在数天内完成多轮进化。针对SAK而言，这一平台也有望加速免疫原性降低、热稳定性提高等方向的变体筛选与优化进程，为新一代溶栓药物的开发提供有力支撑。
参考来源
Tomková M, Hovanová V, Damborsky J, Sedlák E. Rapid screening of staphylokinase protein variants using an unpurified cell-free expression system. FEBS Open Bio. DOI: 未提供（请参考原文信息）