来源：ACS Omega | 编译：DNA Lab Space
漆酶作为一种环境友好的多铜氧化酶，近年被广泛应用于天然产物的结构修饰。近日，研究人员以漆酶为催化剂，系统考察了二氢二苯乙烯类与菲类化合物的生物转化行为，成功获得多种结构新颖的天然产物衍生物，并初步揭示了反应路径。该策略条件温和、选择性良好，为复杂活性分子的绿色衍生化提供了一种简洁而高效的替代方案，也为新药发现提供了宝贵的先导分子库。
研究背景
二氢二苯乙烯（dihydrostilbenes）和菲类（phenanthrenes）化合物是广泛存在于植物中的次生代谢产物，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等多种药理活性。例如，某些菲类化合物表现出显著的细胞毒活性，而二氢二苯乙烯类则是天然抗氧化剂的重要来源。然而，这些天然产物在生物体内含量通常较低，且结构复杂，通过传统化学方法进行结构改造往往需要多步保护基操作，使用贵金属催化剂或有毒氧化剂，不仅成本高昂，还会造成严重的环境污染。因此，开发绿色、温和且具有区域选择性的衍生化手段成为合成化学和天然产物研究领域的重要课题。
漆酶（laccase，EC 1.10.3.2）是一类含铜的氧化酶，能够催化酚类和芳胺类底物的单电子氧化，生成活性自由基中间体，进而发生C–C、C–O或C–N偶联反应。该酶仅需氧气作为终电子受体，副产物为水，因而被誉为“绿色催化剂”。此前，漆酶已被成功用于白藜芦醇、儿茶素等酚类化合物的氧化偶联，但对于二氢二苯乙烯及其环化产物菲类化合物的系统生物转化研究仍相对有限。基于漆酶对酚类结构的广谱催化能力，研究人员推测其同样能够激活二氢二苯乙烯和菲类底物，从而开辟新的化学空间。
研究方法
在这项研究中，作者设计了一套完整的漆酶催化生物转化与产物解析流程。首先，选取了带有不同取代基（包括羟基、甲氧基、糖基等）的二氢二苯乙烯及菲类化合物作为底物，以考察结构差异对转化效率与产物类型的影响。反应体系采用来源于真菌的漆酶作为催化剂，以柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.5～5.0）为介质，在室温条件下持续振荡反应。由于部分底物水溶性较差，体系中加入少量有机助溶剂（如乙醇或二甲基亚砜）。同时设置不添加漆酶的对照实验，以排除非酶氧化背景。反应进程通过薄层色谱（TLC）和高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）进行实时监测，并记录底物特征峰的消失与新产物峰的出现。
当转化率达到平台期后，反应液经乙酸乙酯萃取，有机相浓缩后采用硅胶柱层析进行初步分离，再利用半制备反相HPLC纯化，获得各产物单体。对纯化后的产物，首先通过高分辨电喷雾质谱（HR-ESI-MS）测定精确分子量，推断分子式；随后利用一维核磁共振谱（¹H NMR、¹³C NMR、DEPT）和二维核磁共振谱（COSY、HSQC、HMBC、NOESY/ROESY）系统解析化合物的平面结构。对于可能存在手性中心的产物，则进一步借助圆二色谱（ECD）实验与量子化学ECD计算比对，确定其绝对构型。此外，为了评估新产物在生物活性方面的潜力，还对部分化合物进行了DPPH自由基清除能力测试和抗菌活性初步筛选。整个实验技术路线清晰，将酶催化反应与天然产物化学分离鉴定手段有机结合。
研究结果
研究发现，漆酶能够在温和条件下高效催化多种二氢二苯乙烯和菲类底物发生转化。对不同底物的反应结果分析显示，底物结构中酚羟基的数量与位置显著影响转化速率。含有对位羟基或邻位羟基的底物转化较快，24小时转化率可达到较高水平；而甲氧基取代的底物反应相对缓慢，说明供电子基团有利于漆酶介导的电子转移过程。对于带有吸电子取代基的底物，转化率则明显下降甚至不反应，这一现象与漆酶催化酚类氧化的机理相符。
对产物结构的解析揭示了多样化的反应路径。对于二氢二苯乙烯类底物，漆酶首先将其氧化为苯氧自由基，随后自由基之间发生偶联，主要得到以β–β′、β–O–4′或5′–5′键连接的二聚体产物。值得注意的是，部分二聚体还进一步发生分子内环化，形成具有二氢苯并呋喃或四氢萘骨架的多环结构，这类骨架在天然产物中具有重要的药理活性意义。对于菲类底物，漆酶催化主要生成C–C偶联的双菲衍生物，同时也观察到少量氧杂环化产物，表明反应途径受底物取代模式调控。
高分辨质谱与核磁共振数据确证了产物的结构。多个产物经检索为首次报道的新化合物。例如，由2,3,7-三羟基-5H-二苯并环庚烷型底物转化得到的二聚体具有罕见的轴手性联芳烃结构，其绝对构型通过ECD谱图与理论计算比对得以确定。这类手性联芳烃结构在药物化学中具有特殊价值，而漆酶催化则提供了一种从无手性天然底物直接构建轴手性中心的有效手段。
在活性评价方面，初步抗氧化实验显示，部分漆酶催化产物的DPPH自由基清除能力较母体底物有所增强。这可能是由于二聚化增加了分子中酚羟基数目，或形成了更稳定的共轭体系。抗菌筛选结果则表明，某些双菲类衍生物对革兰氏阳性菌表现出一定的抑制作用，虽然活性强度不高，但为新先导物的进一步修饰提供了线索。
进一步分析底物结构—转化率—产物类型之间的关联后发现，当底物存在两个相邻酚羟基时，漆酶催化往往优先发生分子内氧化环化，生成邻醌类中间体，并进一步二聚。而仅有孤立酚羟基的底物则更倾向于直接进行分子间C–C偶联。这一规律有助于预测漆酶催化的产物结构，为后续理性设计底物以获得目标骨架提供了指导。
讨论与展望
该研究系统展示了漆酶催化在二氢二苯乙烯和菲类化合物结构多样化中的巨大潜力。与传统化学氧化剂（如硝酸银、铁氰化钾）相比，漆酶催化不仅条件温和、副产物少，而且表现出一定的区域选择性和化学选择性，能够直接在含多个活性位点的复杂底物上实现可控偶联。尤其是利用该酶可一步构建轴手性联芳烃和含氧杂环等复杂结构，避免了手性催化剂的昂贵费用和繁琐合成步骤。
当然，当前研究仍面临一些挑战。漆酶催化反应中产物混合物组成往往较复杂，单一产物收率尚不理想；不同底物间的反应选择性和产率波动较大；此外，酶在有机溶剂和极端pH条件下的稳定性限制了其工业化应用。未来可尝试通过漆酶固定化、介体筛选、反应介质工程以及定向进化等手段提高催化效率和选择性。同时，对获取的新衍生物应深入开展抗肿瘤、抗炎等系统活性筛选，并进一步揭示其分子作用机制。总而言之，该研究为天然产物的绿色衍生化提供了新思路，也拓展了漆酶在合成生物学和药物化学中的应用边界，有望推动基于天然分子骨架的新药发现进程。
参考来源
Favre-Godal Q, Marcourt L, Giraud M, Karmime Z, Marcellin-Gros R. Laccase-Catalyzed Biotransformation of Dihydrostilbenes and Phenanthrenes: A Route to Novel Natural Product Derivatives. ACS Omega. DOI: 10.1021/acsomega.XXXXXXX.