来源：Pramocaine hydrochloride potentiates fluconazole against Candida albicans biofilms by targeting Erg12 and inhibiting ubiquinone biosynthesis（Biochemical Pharmacology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
白色念珠菌生物膜对唑类药物的固有耐药性是临床抗感染治疗中的棘手难题。本研究采用药物重定位策略，从2372个FDA已批准化合物中高通量筛选出盐酸普莫卡因——一种低细胞毒性的唑类增效剂。普莫卡因在体内外均显著增强氟康唑抗白色念珠菌生物膜活性，并具有广谱抗念珠菌和隐球菌生物膜效果。机制上，普莫卡因靶向法尼基焦磷酸通路关键酶Erg12，抑制泛醌生物合成，升高线粒体ROS水平，从而削弱菌丝伸长、生物膜厚度及胞外基质分泌。作为已获批药物，普莫卡因具有良好的转化前景。
研究背景
真菌生物膜是包裹在基质中、黏附于彼此及各类表面和界面的复杂微生物群落，可引发头颈部、呼吸道、泌尿生殖道、皮肤及伤口等多种感染，也与留置假体、植入管线和医疗器械相关并发症密切相关。生物膜结构复杂且对抗真菌治疗具有固有耐药性，给临床带来巨大挑战。2022年，全球生物膜相关成本估计约为4万亿美元，其中约4360亿美元影响医疗与人类健康领域（包括口腔护理）。鉴于真菌约占临床生物膜标本的10%，仅真菌生物膜就可能造成约436亿美元的支出。在美国，医疗保健领域管理真菌感染的支出预计每年达72亿美元。植入性医疗器械的广泛使用、免疫抑制剂的应用以及人口老龄化，进一步推动了真菌生物膜相关疾病患病率的上升。这一趋势凸显了加强诊断和治疗策略以有效应对日益加重的疾病负担的紧迫需求。
研究方法
2.1 菌株、细胞系、试剂与培养条件
本研究所用菌株和引物详见表3和表4。所有菌株均在酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）（生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海）中培养，温度30°C，在轨道摇床中以200 rpm振荡。对于生物膜生长实验，真菌生物膜在37°C下于RPMI 1640培养基（10 g/L RPMI medium 1640粉末、34.5 g/L 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）、2 g/L NaHCO₃、2.7 g/L NaOH，调节pH至7.0）（CellorLab，中国上海）中培养。所有菌株以甘油菌形式保存于-80°C，随后在YPD琼脂平板上传代培养。人结直肠腺癌细胞（Caco-2；YCL-0363）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和小鼠单核巨噬细胞（J774A.1）均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC：HTB-37）。这些细胞系在高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，补充10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（100×）（CellorLab，中国上海），条件为37°C、5% CO₂。包含2372个FDA已批准化合物的化合物库购自MedChemExpress（中国上海），以10 mM储备液形式溶于二甲基亚砜（DMSO）并保存于96孔板中。
【数据】培养基：YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）；培养温度：30°C；振荡转速：200 rpm；生物膜培养基：RPMI 1640（pH 7.0）；生物膜培养温度：37°C；化合物库规模：2372个FDA已批准化合物；储备液浓度：10 mM（DMSO）；细胞培养条件：37°C、5% CO₂；血清浓度：10% FBS；抗生素：1%青霉素-链霉素（100×）；保存温度：-80°C
2.2 生物膜形成与湿重生物膜测量
真菌生物膜形成按照先前建立的方法进行[31,32]。简言之，真菌菌株在YPD培养基中于30°C过夜培养，随后重悬于RPMI 1640培养基中至终浓度1 × 10⁶ cells/mL。此后，将100 μL细胞悬液加入96孔板每孔，或将1 mL加入24孔板每孔，于37°C孵育。孵育90分钟后，用200 μL磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤孔以去除未黏附细胞。随后加入含或不含药物的新鲜RPMI 1640培养基，继续孵育24小时。为测定生物膜湿重，用无菌细胞刮刀收集生物膜，悬浮于去离子水（ddH₂O）中，转移至预先称重的定量滤纸上。载有生物膜的滤纸经真空过滤去除多余水分后称重。每组平均湿重由三个样品计算，扣除滤纸质量以获得净生物膜重量。
【数据】过夜培养温度：30°C；细胞接种浓度：1 × 10⁶ cells/mL；96孔板接种体积：100 μL；24孔板接种体积：1 mL；孵育温度：37°C；黏附时间：90分钟；洗涤体积：200 μL PBS；药物处理孵育时间：24小时；每组样品数：3
2.3 XTT还原实验
采用2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺（XTT）还原实验评估不同化合物对白色念珠菌生物膜形成的影响，通过测量生物膜代谢活性，方法如先前所述[33,34]。生物膜按前述方法制备，加入含FLC和待测化合物的新鲜培养基，孵育24小时。随后吸去孔中培养基，每孔加入90 μL浓度为0.5 mg/mL的XTT溶液（MedChemExpress，中国上海）以及10 μL浓度为0.32 mg/mL的吩嗪硫酸甲酯（阿拉丁，中国上海），孵育30分钟。孵育后，使用分光光度计（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）在492 nm处测量生物膜吸光度。吸光度值减去背景对照孔吸光度进行校正。生物膜形成百分比通过各样品吸光度除以未处理生物膜对照孔吸光度计算。
【数据】XTT浓度：0.5 mg/mL；XTT体积：90 μL；吩嗪硫酸甲酯浓度：0.32 mg/mL；吩嗪硫酸甲酯体积：10 μL；孵育时间：30分钟；检测波长：492 nm；药物处理孵育时间：24小时
2.4 细胞毒性实验
采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验评估不同化合物对哺乳动物细胞的细胞毒性作用，方法如先前所述[35]。Caco-2和HUVEC细胞培养至70-80%汇合度。随后用DMEM培养基冲洗细胞，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA（CellorLab，中国上海）孵育2分钟。使用Countess 3自动细胞计数仪（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）定量细胞密度，将100 μL中5 × 10⁴ cells/mL（每孔5000个细胞）的细胞悬液加入96孔板每孔，于37°C孵育16小时。为评估化合物与FLC的协同毒性，在新96孔板中将待测化合物纵向二倍系列稀释，FLC横向二倍系列稀释。随后将细胞与100 μL稀释后的化合物和FLC于37°C共培养24小时。24小时孵育后，细胞用10% CCK-8（TargetMol，Boston，MA，USA）在暗处染色2小时。使用分光光度计（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）在450 nm处测量吸光度。所有实验均设三复孔，半数最大效应浓度（EC₅₀）值使用GraphPad Prism 10.1.2版确定。结果以平均值 ± 标准差（SD）表示。
【数据】细胞汇合度：70-80%；胰蛋白酶浓度：0.25% Trypsin-EDTA；消化时间：2分钟；细胞接种密度：5 × 10⁴ cells/mL（每孔5000个细胞）；接种体积：100 μL；贴壁孵育温度：37°C；贴壁时间：16小时；化合物与FLC共培养温度：37°C；共培养时间：24小时；CCK-8浓度：10%；染色时间：2小时（暗处）；检测波长：450 nm；复孔数：3
2.5 白色念珠菌生物膜与巨噬细胞共培养
我们修改了现有的白色念珠菌与巨噬细胞共孵育实验方案，以验证特定化合物与FLC联合应用在巨噬细胞存在下对生物膜的破坏作用[36]。简言之，白色念珠菌生物膜按前述方法在24孔板中建立。J774A.1巨噬细胞培养至70-80%汇合度，随后在补充10% FBS的RPMI 1640培养基中稀释至1 × 10⁵ cells/mL。将1 mL稀释后的巨噬细胞悬液加入白色念珠菌生物膜中，同时加入或不加入12.5 μM FLC和12.5 μM待测化合物。无巨噬细胞条件下形成的生物膜作为对照。在37°C、5% CO₂气氛中孵育24小时后，使用倒置显微镜（Motic，中国厦门）对生物膜进行图像记录，所得图像使用Adobe Photoshop软件处理。
【数据】巨噬细胞汇合度：70-80%；巨噬细胞浓度：1 × 10⁵ cells/mL；FBS浓度：10%；巨噬细胞悬液体积：1 mL；FLC浓度：12.5 μM；待测化合物浓度：12.5 μM；孵育温度：37°C；CO₂浓度：5%；孵育时间：24小时
2.6 菌丝生长抑制实验
菌丝生长抑制实验按照先前描述的方法进行[32]。简言之，白色念珠菌在YPD培养基中过夜培养，随后用PBS缓冲液洗涤三次，在RPMI 1640培养基中稀释至1 × 10⁴ cells/mL。将1 mL该细胞悬液分装至24孔板每孔。随后，分别向相应孔中加入FLC、普莫卡因及其组合处理。在37°C孵育6小时后，使用倒置显微镜（Motic，中国厦门）观察并记录菌丝。使用ImageJ软件以微米为单位定量菌丝长度。
【数据】细胞浓度：1 × 10⁴ cells/mL；细胞悬液体积：1 mL；孵育温度：37°C；孵育时间：6小时；洗涤次数：3次（PBS）
2.7 生物膜胞外基质（ECM）检测
生物膜ECM的分离按照已建立的方案进行[37]。白色念珠菌生物膜在24孔板中于37°C培养24小时。孵育后，去除培养基，用ddH₂O洗涤生物膜两次。使用无菌细胞刮刀将生物膜收集至ddH₂O中。随后使用超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司，中国宁波）在20 kHz条件下超声处理5分钟。此后，在真空压力下通过滤纸过滤悬液以分离基质。所得滤液即为ECM，截留的固体物质为生物量。使用微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）测定滤液中核酸和蛋白质浓度。
【数据】生物膜培养温度：37°C；培养时间：24小时；洗涤次数：2次（ddH₂O）；超声频率：20 kHz；超声时间：5分钟
2.8 共聚焦显微镜分析生物膜生长
为便于通过共聚焦显微镜观察生物膜……（原文此处截断）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 高通量筛选鉴定出普莫卡因为低毒FLC增效剂，具有巨噬细胞协同作用和广谱抗生物膜活性
对包含2372个FDA已批准化合物的化合物库进行高通量筛选，以鉴定能增强FLC抗白色念珠菌生物膜活性的潜在唑类增敏剂。化合物评估采用XTT还原实验，检测100 μM各化合物与12.5 μM FLC组合的抗白色念珠菌生物膜活性（图1a）。处理24小时后，观察到279个化合物与FLC组合导致白色念珠菌生物膜形成抑制率超过90%，而单独FLC处理的细胞几乎能形成完整生物膜（图1a和1b）。
随后，采用XTT还原实验检测279个化合物在100 μM至1.5625 μM浓度范围内与12.5 μM FLC的组合效果。结果显示，27个化合物能增强FLC的抗真菌活性，在浓度低于12.5 μM时即可实现超过90%的生物膜形成抑制（图1c）。随后使用剂量矩阵滴定XTT还原实验评估这27个化合物与FLC的协同相互作用潜力。FLC浓度范围为64 μg/mL至1 μg/mL，27个化合物浓度范围为25 μM至0.3906 μM。结果显示，其中18个化合物与FLC抗白色念珠菌生物膜呈现协同（FICI ≤ 0.5）或相加（0.5 < FICI ≤ 1）相互作用（图1d，表1）。
我们对18个化合物对Caco-2细胞和HUVEC的细胞毒性进行了综合评估。在Caco-2细胞中，单独FLC的EC₅₀超过200 μM。在测试化合物中，有九个——西立伐他汀钠、氟伐他汀钠、普莫卡因、特比萘芬、环吡酮胺、硝羟喹啉、奥希替尼、氯喹那多和匹伐他汀钙——EC₅₀值大于25 μM。苯扎氯铵的EC₅₀值为23.33 ± 0.33 μM。值得注意的是，奥希替尼和苯扎氯铵与FLC联合给药时显著增强了FLC的细胞毒性（表2）。在HUVEC中，单独FLC的EC₅₀同样超过200 μM。八个化合物——西立伐他汀钠、氟伐他汀钠、普莫卡因、特比萘芬、环吡酮胺、硝羟喹啉、氯喹那多和匹伐他汀钙——EC₅₀值也超过25 μM。其中，环吡酮胺、硝羟喹啉、氯喹那多和匹伐他汀钙在联合给药时观察到增强FLC的细胞毒性效应（表2）。此外，降脂药西立伐他汀钠因与致死性横纹肌溶解症相关而从全球市场撤出[16,43]。因此，提出氟伐他汀钠、普莫卡因和特比萘芬三个化合物作为潜在唑类佐剂进行进一步评估。
白色念珠菌能够在体内通过形成生物膜逃避巨噬细胞吞噬[44]。因此，我们研究了氟伐他汀钠、普莫卡因和特比萘芬在有无FLC存在条件下是否能增强巨噬细胞抗白色念珠菌生物膜的活性。结果显示，仅在两种条件下普莫卡因均显著增强了巨噬细胞抗白色念珠菌生物膜的活性（图1e）。因此，选择普莫卡因作为抗白色念珠菌生物膜的潜在FLC增效剂进行进一步研究。
卡泊芬净属于棘白菌素类，被认为是临床上抗白色念珠菌生物膜最有效的抗真菌药物[2]。因此，使用卡泊芬净作为阳性对照，通过XTT还原实验进一步评估FLC和普莫卡因组合对多种念珠菌和隐球菌（包括白色念珠菌、季也蒙念珠菌、新型隐球菌和格特隐球菌）的抗生物膜效果。结果显示，1 μM卡泊芬净显著抑制白色念珠菌生物膜形成，相对生长率为6.81 ± 4.88%（p < 0.0001，与对照组比较），但不影响季也蒙念珠菌、新型隐球菌或格特隐球菌的生物膜形成。相比之下，4 μM FLC显著抑制格特隐球菌生物膜形成，相对生长率为3.03 ± 2.37%（p < 0.0001），但对白色念珠菌、季也蒙念珠菌和新型隐球菌无效。值得注意的是，FLC（4 μM）和普莫卡因（12.5 μM）组合显著抑制了所有测试物种的生物膜形成。具体而言，生物膜相对生长率分别降至白色念珠菌13.01 ± 13.70%、季也蒙念珠菌30.36 ± 6.72%、新型隐球菌21.93 ± 10.63%、格特隐球菌1.71 ± 1.19%，所有结果均具有统计学显著性（p < 0.0001）（图1f）。这一发现凸显了FLC和普莫卡因组合对多种念珠菌和隐球菌具有广谱抗生物膜活性的潜力。
【数据】化合物库规模：2372个FDA已批准化合物；筛选浓度：100 μM化合物 + 12.5 μM FLC；处理时间：24小时；初筛抑制率>90%的化合物数：279个；浓度范围：100 μM至1.5625 μM；复筛抑制率>90%且浓度<12.5 μM的化合物数：27个；FLC浓度范围：64 μg/mL至1 μg/mL；化合物浓度范围：25 μM至0.3906 μM；协同/相加化合物数：18个（FICI ≤ 0.5或0.5 < FICI ≤ 1）；Caco-2细胞中FLC EC₅₀：>200 μM；EC₅₀>25 μM的化合物数：9个（Caco-2）/ 8个（HUVEC）；苯扎氯铵EC₅₀：23.33 ± 0.33 μM；卡泊芬净浓度：1 μM；白色念珠菌相对生长率（卡泊芬净）：6.81 ± 4.88%（p < 0.0001）；FLC浓度：4 μM；格特隐球菌相对生长率（FLC单用）：3.03 ± 2.37%（p < 0.0001）；普莫卡因浓度：12.5 μM；白色念珠菌相对生长率（联合）：13.01 ± 13.70%；季也蒙念珠菌相对生长率（联合）：30.36 ± 6.72%；新型隐球菌相对生长率（联合）：21.93 ± 10.63%；格特隐球菌相对生长率（联合）：1.71 ± 1.19%；所有联合组p < 0.0001
3.2 FLC与普莫卡因组合通过减少菌丝长度、减薄生物膜厚度和抑制ECM分泌破坏白色念珠菌生物膜结构
菌丝细胞对维持白色念珠菌生物膜结构的架构稳定性至关重要，使其呈现具有明显层次并被胞外基质包被的厚实外观[45]。因此，我们进一步检测了FLC和普莫卡因联合处理对白色念珠菌菌丝生长的影响。结果显示，4 μM FLC和12.5 μM普莫卡因组合显著降低白色念珠菌菌丝长度，为11.74 ± 2.60 μm，而4 μM FLC组为23.50 ± 4.72 μm，对照组为65.69 ± 7.96 μm（图2a，b）。
为评估该组合对白色念珠菌生物膜结构的影响，我们采用共聚焦扫描激光显微镜（CSLM）以硅胶方块表征生物膜形态。对照组和单独12.5 μM普莫卡因处理组表现出完整生物膜结构，厚度范围为100 μm至160 μm。相比之下，4 μM FLC处理组形成的生物膜厚度约为60 μm，菌丝在硅胶方块表面水平排列。在FLC（4 μM）和普莫卡因（12.5 μM）处理的生物膜中，生物膜厚度约为20 μm，菌丝形成显著减少（图2c）。
ECM是生物膜的重要组成部分，在生物膜发育成熟阶段迅速积累。白色念珠菌ECM由糖蛋白、碳水化合物、脂质和核酸组成[46]。本研究中，我们评估了培养基中蛋白质和核酸含量以表征白色念珠菌生物膜ECM。生物膜分别用4 μM FLC、12.5 μM普莫卡因、两者组合处理，或未处理作为对照。对照条件下，DNA和蛋白质浓度分别为60.9 ± 0.61 μg/mL和0.72 ± 0.01 mg/mL。相比之下，FLC和普莫卡因联合处理组DNA和蛋白质浓度显著降低，分别为7.14 ± 0.97 μg/mL（p < 0.0001）和0.08 ± 0.01 mg/mL（p < 0.0001）（图2d和2e）。此外，FLC和普莫卡因联合处理的白色念珠菌生物膜湿重降低至0.18 ± 0.01 g，而对照组为0.37 ± 0.02 g（图2f）。总体而言，FLC和普莫卡因联合应用通过减少菌丝长度、减薄生物膜和减少ECM量有效抑制白色念珠菌生物膜形成。
【数据】FLC浓度：4 μM；普莫卡因浓度：12.5 μM；菌丝长度（联合组）：11.74 ± 2.60 μm；菌丝长度（FLC单用）：23.50 ± 4.72 μm；菌丝长度（对照）：65.69 ± 7.96 μm；生物膜厚度（对照/普莫卡因单用）：100-160 μm；生物膜厚度（FLC单用）：约60 μm；生物膜厚度（联合）：约20 μm；DNA浓度（对照）：60.9 ± 0.61 μg/mL；蛋白质浓度（对照）：0.72 ± 0.01 mg/mL；DNA浓度（联合）：7.14 ± 0.97 μg/mL（p < 0.0001）；蛋白质浓度（联合）：0.08 ± 0.01 mg/mL（p < 0.0001）；生物膜湿重（对照）：0.37 ± 0.02 g；生物膜湿重（联合）：0.18 ± 0.01 g
3.3 FLC联合普莫卡因在小鼠皮下导管感染模型中显著抑制白色念珠菌生物膜形成
我们进行了体内实验……（原文此处截断）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究采用药物重定位策略，对2372个FDA已批准化合物进行高通量筛选，鉴定出普莫卡因作为FLC抗白色念珠菌生物膜的有效增效剂。研究结果表明，普莫卡因通过特异性靶向法尼基-PP通路关键酶Erg12，在体内外显著增强FLC的抗真菌效力。该靶向相互作用抑制泛醌生物合成，升高线粒体ROS水平，破坏线粒体功能，最终减少白色念珠菌菌丝伸长、生物膜厚度和ECM分泌（图7）。
本研究不仅揭示了唑类增效的新机制，还提供了一种具有临床转化潜力的策略，以应对白色念珠菌生物膜对唑类耐药这一紧迫挑战。靶向真菌代谢通路关键节点的联合治疗已成为克服白色念珠菌唑类耐药的有前景的方法[19,24,53]。现有唑类增效剂主要通过干扰麦角固醇生物合成通路发挥作用：特比萘芬抑制Erg1进一步降低麦角固醇水平[23]，CZ66靶向Erg251阻断14α-甲基固醇合成并赋予唑类杀菌活性[22]，匹伐他汀抑制Hmg1破坏泛醌生物合成并诱导氧化应激[16]。然而，普莫卡因展现出独特的作用机制……（原文此处截断）
编译者解读
该研究最巧妙之处在于将药物重定位与代谢通路靶向结合——普莫卡因作为已获批的局部麻醉药，其安全性已有充分临床数据支撑，省去了先导化合物优化的漫长过程。靶向Erg12而非传统麦角固醇通路，避开了现有唑类耐药机制的交叉影响，这一策略对克服生物膜耐药具有参考价值。不过，研究目前仅验证了皮下导管感染模型，对于更复杂的系统性感染和体内长期安全性仍需进一步评估。此外，普莫卡因增强巨噬细胞杀菌活性的具体分子机制尚待深入解析。
参考来源
期刊：Biochemical Pharmacology, 2026
DOI: 10.1016/j.bcp.2026.118302
DOI: 10.1016/j.bcp.2026.118302