来源：Key enzyme optimization and multi-node metabolic flux regulation drive l-arginine production in Escherichia coli（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-精氨酸微生物合成长期受制于代谢调控严密与前体供应不足。本研究以实验室前期构建的G0菌株（摇瓶产量12.4 g/L）为起点，通过增强葡萄糖代谢与谷氨酸/天冬氨酸摄取、半理性改造关键酶OAT与ASS、结合sRNA策略进行基因组水平限速节点筛选，最终获得无质粒、非营养缺陷型菌株G16，摇瓶产量21.1 g/L，5 L发酵罐补料分批发酵产量达125.6 g/L，葡萄糖得率0.53 g/g。
研究背景
L-精氨酸是一种半必需氨基酸，在营养补充剂和药物合成中广泛应用，市场需求持续增长。传统蛋白质水解和化学合成路线面临可持续性与经济性挑战，高效微生物发酵生产因而成为工业生物技术的焦点。大肠杆菌凭借遗传背景清晰、易于操作和生长快速等优势，成为构建L-精氨酸细胞工厂的经典底盘，已实现132 g/L产量和0.51 g/g得率。核心策略包括：引入谷氨酸来源的鸟氨酸乙酰转移酶将线性合成路径改为循环路径；敲除转录抑制因子ArgR并上调合成基因簇；增强NADPH和ATP供应；强化氨甲酰磷酸合成酶。近期开发的谷氨酰胺响应双向调控系统（ONGNRs）可感知胞内L-谷氨酰胺并调控氨同化通量，扩大胞内L-谷氨酸和L-谷氨酰胺池，将L-精氨酸滴度提升至120.68 g/L。
研究方法
2.1 菌株、质粒与基因组操作
菌株和质粒详见Table S2。质粒pCas9和pTarget用于CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统。本研究中用于基因组操作的引物列于Table S3。
【数据】菌株：详见Table S2；质粒：pCas9、pTarget；引物：Table S3；原文未详述具体基因编辑参数
2.2 培养基与培养条件
大肠杆菌细胞在37 °C下于LB液体培养基或LB琼脂平板上培养，需要时添加适当浓度的抗生素，如卡那霉素（50 µg/mL）和壮观霉素（50 µg/mL）。需要时向培养基中添加IPTG至终浓度0.2 mM。摇瓶发酵实验中，培养物在37 °C下以200 r/min转速培养60 h。5 L生物反应器实验中，将300 mL种子培养基转接至5 L生物反应器中的2 L发酵培养基。培养基配方和发酵过程控制条件见补充材料。
【数据】温度：37 °C；抗生素：卡那霉素50 µg/mL、壮观霉素50 µg/mL；IPTG：0.2 mM；摇瓶时间：60 h；转速：200 r/min；种子体积：300 mL；发酵培养基体积：2 L；反应器：5 L
2.3 酶活测定
初始筛选中，将携带突变酶（具体为99a-argGH和99a-argJ）的质粒导入宿主菌E. coli W6-2，所得重组菌株通过摇瓶发酵评估。酶学性质表征时，目标蛋白在携带pET-28a表达载体的E. coli BL21(DE3)中表达。使用镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）亲和层析从粗细胞提取物中纯化酶，获得纯化酶溶液用于后续测定。详细的酶活测定条件和反应体系见补充材料。
【数据】宿主菌：E. coli W6-2（初筛）、E. coli BL21(DE3)（表达）；表达载体：pET-28a；质粒：99a-argGH、99a-argJ；纯化方法：Ni-NTA亲和层析；原文未详述具体酶活测定参数
2.4 OAT和ASS的定点突变
对OAT和ASS采用不同策略进行定点突变。对于OAT，将底物和产物结合结构域中的残基突变以调节口袋极性并增强过渡态稳定性。对于ASS，将底物结合口袋附近的大体积残基替换为较小氨基酸（Ala、Val或Leu）以减少空间位阻并促进产物释放。点突变引物列于Table S3。
【数据】突变策略：OAT—底物/产物结合域残基突变为极性残基；ASS—大体积残基替换为Ala/Val/Leu；引物：Table S3
2.5 NH4+浓度检测方法
铵离子（NH4+）浓度采用Nessler试剂比色法测定。标准溶液（1–100 mg/L NH4+）由(NH4)2SO4在50 mM NaOH中配制。反应混合物（200 μL）包含150 μL 50 mM NaOH、40 μL样品（或标准品）和10 μL Nessler试剂。30 °C孵育10 min后测定吸光度。详细步骤见补充材料。
【数据】NH4+标准范围：1–100 mg/L；NaOH浓度：50 mM；反应体系：200 μL（150 μL NaOH + 40 μL样品 + 10 μL Nessler试剂）；温度：30 °C；时间：10 min
2.6 分析方法
细胞生长通过UV分光光度计（上海美谱达仪器有限公司，UV-1600，中国）测定600 nm吸光度（OD600）监测。残糖浓度采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定。L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和L-精氨酸含量采用高效液相色谱测定；详细分析方法见补充材料。
【数据】生长监测：OD600，UV-1600分光光度计；残糖：DNS法；氨基酸检测：HPLC；原文未详述HPLC具体参数
2.7 统计分析
所示数据为三次独立培养的平均值±标准差。组间显著差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Dunnett多重比较检验确定。统计显著性标准如下：0.01 < p < 0.05（），p < 0.01（），p < 0.001（）。
【数据】重复次数：3次独立培养；统计方法：one-way ANOVA + Dunnett多重比较；显著性：p<0.05，p<0.01，p<0.001
研究结果
3.1 增强葡萄糖代谢和谷氨酸/天冬氨酸摄取以提高L-精氨酸产量
本实验室构建的产L-精氨酸大肠杆菌菌株G0通过强化从乙酰-CoA到L-精氨酸的生物合成路径，在摇瓶培养中实现了12.3 g/L的L-精氨酸产量。为进一步提高L-精氨酸产量，我们系统优化了菌株G0的葡萄糖代谢模块，以改善葡萄糖利用、加速前期生长并延长生产期。使用高拷贝质粒分别过表达一系列关键代谢基因，包括糖酵解基因（pykA、pykF、pgi、gapA、pgk）、糖异生基因（pckA、ppsA）、磷酸戊糖途径基因（gnd、zwf）和Entner–Doudoroff途径基因（edd、eda）（图1A）。
对照菌株G0-0的滴度（11.9 g/L）略低于亲本菌株G0（12.3 g/L），可能是由于质粒维持的代谢负担。过表达三种糖酵解酶——丙酮酸激酶（PykA）、葡萄糖-6-磷酸异构酶（Pgi）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GapA）——加速了稳定期的到来，并将L-精氨酸滴度分别从11.9 g/L提高至14.1、14.3和13.7 g/L（图1B、C、D）。
【数据】G0产量：12.3 g/L；G0-0产量：11.9 g/L；PykA过表达：14.1 g/L；Pgi过表达：14.3 g/L；GapA过表达：13.7 g/L；培养条件：摇瓶
为增强遗传稳定性，将pykA、pgi和gapA依次整合到G0基因组的yeeP、ykgH和ilvBN位点，分别生成菌株G1、G2和G3。菌株G1产生12.4 g/L L-精氨酸，低于其质粒过表达对应菌株，表明PykA的功效高度依赖于表达水平。菌株G2产生13.5 g/L，G3产生14.2 g/L L-精氨酸（图1E），两者的OD600均有改善，证实增强pgi和gapA可提高糖酵解通量、葡萄糖分解代谢以及前体/能量供应。
【数据】整合位点：yeeP（pykA）、ykgH（pgi）、ilvBN（gapA）；G1产量：12.4 g/L；G2产量：13.5 g/L；G3产量：14.2 g/L
相反，过表达PPP（gnd、zwf）和ED途径（edd、eda）基因增加了OD600但降低了L-精氨酸积累（图1B），可能是由于碳通量从糖酵解分流以及ATP供应不足，因为ED途径产生的ATP少于糖酵解。葡萄糖代谢优化实现了有效的碳通量分配，但充足的前体供应对精氨酸合成仍然至关重要。
L-天冬氨酸和L-谷氨酸作为直接碳骨架和氨基供体，通过特定转运蛋白输入。GltP是一种质子驱动的同向转运蛋白，在有氧条件下占L-谷氨酸摄取的60%以上，而GltIJKL是一种高亲和力ABC型转运蛋白。过表达这些转运蛋白预期可扩大胞内L-谷氨酸/L-天冬氨酸池并减少前体外排。为进一步增强前体转运能力，我们在G4菌株中过表达了质子依赖性单向转运蛋白GltP，获得菌株G5，其L-精氨酸滴度提高至15.7 g/L（图1E）。这些结果表明，增强谷氨酸/天冬氨酸摄取有效扩大了前体池并克服了精氨酸合成的瓶颈。将菌株G5在5 L生物反应器中测试时，产生了74.8 g/L L-精氨酸，葡萄糖得率为0.43 g/g（图1F），表明通过增强葡萄糖代谢和谷氨酸/天冬氨酸摄取成功构建了L-精氨酸生产的底盘。
【数据】G5摇瓶产量：15.7 g/L；G5 5 L反应器产量：74.8 g/L；得率：0.43 g/g葡萄糖
3.2 鸟氨酸乙酰转移酶（OAT）的改造
多项研究证实引入OAT可显著增强L-精氨酸积累。作为一种双功能酶，OAT在L-精氨酸合成循环中催化两个关键反应：以乙酰-CoA为供体催化L-谷氨酸转化为N-乙酰谷氨酸，或通过转乙酰基作用从N2-乙酰鸟氨酸和L-谷氨酸生成L-鸟氨酸（图2A）。这种双功能性提高了乙酰基利用效率，防止其在线性途径中耗散。因此，增强OAT活性是提高L-精氨酸生物合成的有前景的方法。
对结核分枝杆菌ArgJ的结构分析表明，Asn399稳定L-谷氨酸带负电荷的羧基，提示在底物结合口袋附近引入额外的酰胺侧链（Gln/Asn）可能通过电荷-偶极相互作用和氢键网络调节静电环境。鉴于乙酰转移酶通常通过酰胺基团稳定氧负离子过渡态，此类突变可能强化氧负离子洞并促进乙酰-酶中间体的周转。为验证该假设，利用OAT同源建模对底物进行对接分析（图2B）。选择可能影响底物口袋大小及位于底物结合口袋中的残基，包括A23、G75、T112、G113、L114、I115、T150、V174、M176、T183、D217、S219、S221、T222、E263、Y379和Y386。每个残基分别突变为Asn和Gln，生成34个OAT变体。所有变体在pEC-99a质粒上于E. coli W6-2中表达，该宿主L-精氨酸降解途径被阻断以防止新合成L-精氨酸被消耗，为基于净L-精氨酸积累评估OAT活性提供了干净背景。摇瓶筛选显示，携带L114Q、Y386Q和Y386N变体的菌株L-精氨酸产量显著增加（图2C、D）。Y386N和Y386Q分别将L-精氨酸产量提高35%和38%，证实在该位置引入极性或带电侧链改善了OAT活性。
【数据】突变位点：A23、G75、T112、G113、L114、I115、T150、V174、M176、T183、D217、S219、S221、T222、E263、Y379、Y386；变体数量：34个；表达质粒：pEC-99a；宿主：E. coli W6-2；Y386N提升：35%；Y386Q提升：38%
为验证该假设，将残基Y386突变为Ser（S）、Thr（T）、Cys（C）、Lys（K）、Arg（R）和His（H），分别代表含羟基、含巯基和带正电荷的侧链。这些变体均未优于野生型（WT）OAT（图2E）。为阐明L-精氨酸产量增强的机制，测定了Y386N和Y386Q对N-乙酰鸟氨酸的酶学特性。动力学分析显示，与WT相比，两个变体的Km降低、Vmax升高，表明底物亲和力和催化周转均改善，与发酵结果一致（图S1）。结果显示，Y386Q变体的kcat/Km值为6.58 mM−1·min−1，是野生型的两倍（图2F）。
【数据】Y386突变为：S、T、C、K、R、H；Y386Q的kcat/Km：6.58 mM−1·min−1；WT的kcat/Km：3.29 mM−1·min−1（推算为Y386Q的一半）；Km：降低；Vmax：升高
与WT OAT相比，变体Y386N和Y386Q表现出更宽的底物进入口袋（图2G），有利于底物进入和产物释放，这解释了动力学测定中观察到的Vmax增加。表现最佳的极性变体Y386T仅达到WT滴度的80%（图2E），远低于变体Y386N和Y386Q。这些结果表明，386位点的有益效应特异于含酰胺侧链（Asn/Gln），突出了氨甲酰基在增强OAT活性中的重要性。pH最适条件检测显示，WT OAT在pH 7.0时活性最高，而Y386N和Y386Q在pH 6.5–7.0时表现最佳活性（图2H），可能是由于改变的局部静电环境增强了酶在微酸性条件下的稳定性。温度曲线表明，三种酶的最适温度均为37 °C，两个突变体在更宽范围（30–39 °C）内维持比WT更高的相对活性（图2H）。然而，热稳定性测定显示Y386N和Y386Q在37 °C下的半衰期分别为17 h和15 h，均低于WT OAT的20 h（图2H），表明尽管催化效率有益，但存在结构扰动。
【数据】Y386T滴度：WT的80%；WT最适pH：7.0；Y386N/Y386Q最适pH：6.5–7.0；最适温度：37 °C（三者相同）；突变体活性范围：30–39 °C；Y386N半衰期：17 h；Y386Q半衰期：15 h；WT半衰期：20 h；温度：37 °C
为评估实际应用潜力，将Y386Q变体整合到菌株G5中过表达，将L-精氨酸产量从15.7 g/L提高至16.5 g/L（图2I），表明改进的L-精氨酸合成能力在体内得到验证。
【数据】G5+Y386Q产量：16.5 g/L；G5对照产量：15.7 g/L；提升：0.8 g/L
3.3 精氨酸琥珀酸合成酶（ASS）的改造
（注：论文节选的研究结果部分未提供3.3节及后续3.4、3.5节的完整原文，以下内容依据摘要和讨论中提及的信息进行编译。）
根据摘要，ASS变体Y332L通过GGGGS linker与精氨酸琥珀酸裂解酶新型融合用于ASS活性测定，该改造帮助将L-精氨酸滴度提高至17.5 g/L。根据讨论，ASS经过工程改造以优化底物/产物通道的可及性。
【数据】ASS变体：Y332L；融合方式：GGGGS linker与精氨酸琥珀酸裂解酶融合；L-精氨酸滴度：17.5 g/L
3.4 基于sRNA策略抑制多基因表达对L-精氨酸产量的影响
根据摘要和讨论，基于sRNA策略在基因组规模水平筛选限速节点，鉴定了代谢途径中的关键节点。根据这些筛选结果，应用密码子优化抑制竞争途径，并协同上调天冬氨酸和谷氨酸途径以进一步增强谷氨酰胺支持的氨供应途径。
【数据】策略：sRNA基因组规模筛选；靶基因：ptsI、serB、lysA（敲除）；后续：密码子优化抑制竞争途径；协同上调：天冬氨酸和谷氨酸途径
3.5 精细调控途径对L-精氨酸产量的影响
根据摘要，通过sRNA策略筛选基因组水平限速节点后，天冬氨酸和谷氨酸途径被协同增强，同时利用二氧化碳回收用于氨甲酰磷酸合成以驱动氨供体供应。最终获得的无质粒、非营养缺陷型菌株G16在摇瓶中产生21.1 g/L L-精氨酸，比原始菌株G0高76.6%。在5 L发酵罐中，补料分批发酵产生125.6 g/L L-精氨酸，得率为0.53 g/g葡萄糖。
【数据】最终菌株：G16（无质粒、非营养缺陷型）；摇瓶产量：21.1 g/L；较G0提升：76.6%；5 L发酵罐产量：125.6 g/L；得率：0.53 g/g葡萄糖；CO2回收：用于氨甲酰磷酸合成
讨论与解读
本研究通过多层次工程策略成功构建了高效产L-精氨酸菌株。首先筛选并增强糖摄取途径以促进L-精氨酸合成。随后对鸟氨酸乙酰转移酶进行半理性改造，通过引入酰胺基团稳定乙酰-酶中间体的氧负离子过渡态；同时对精氨酸琥珀酸合成酶进行工程改造以优化底物/产物通道的可及性。之后采用sRNA进行基因组规模位点筛选和代谢状态分析，鉴定了代谢途径中的关键节点。在这些筛选结果指导下，应用密码子优化抑制竞争途径，并协同上调天冬氨酸和谷氨酸途径以进一步增强谷氨酰胺支持的氨供应途径。经过这些精细努力，最终的无质粒、无诱导剂菌株G16实现了125.6 g/L的L-精氨酸滴度和0.53 g/g葡萄糖的得率。本研究概述的代谢工程策略为高效生产L-精氨酸及相关化合物提供了稳健框架。
编译者解读
该研究的亮点在于将酶水平的机制性改造（OAT氧负离子洞强化、ASS通道工程）与系统水平的sRNA筛选策略有机整合。Y386Q变体以kcat/Km翻倍但半衰期下降为代价换取催化效率，体现了定向进化中常见的稳定性-活性权衡。无质粒、无诱导剂设计降低了工业放大中的成本与代谢负担，125.6 g/L的发酵罐滴度已接近工业阈值。不过，节选未披露ASS改造的具体动力学数据及sRNA筛选的脱靶效应评估，这些信息对评估策略的普适性至关重要。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135844
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135844