来源：Engineering Escherichia coli BL21(DE3) for efficient production of D-allulose from D-glucose via phosphorylation/epimerization/dephosphorylation pathway（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
D-阿洛酮糖是一种低热量功能性甜味剂，工业上主要依赖可逆的D-果糖差向异构化生产。本研究在大肠杆菌BL21(DE3)中构建了热力学有利的磷酸化/差向异构化/去磷酸化合成途径，引入大肠杆菌来源的D-阿洛酮糖-6-磷酸3-差向异构酶（AlsE）和热纤梭菌来源的D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶（CtA6PP），并通过敲除竞争途径基因、启动子工程和RBS工程精细调控表达。优化菌株在试管培养中产量达5.26 g/L，补料分批发酵中达33.05 g/L，D-葡萄糖得率为0.69 g/g。
研究背景
D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，天然存在于Itea属植物和小麦等少数植物中，含量极微。其甜度约为蔗糖的70%，热量却不足10%，是极具潜力的蔗糖替代品。除低热量特性外，研究还提示D-阿洛酮糖具有血糖血脂调节、抗炎和神经保护等健康促进潜力。在食品加工中，它能与蛋白质发生美拉德反应，改善烘焙产品的色泽、香气和抗氧化能力，并增强蛋白质凝胶化；还能有效降低冷冻甜点的冰点；同时通过提高淀粉糊化温度、延缓回生来改善烘焙产品的质构和货架期。这些特性使D-阿洛酮糖成为烘焙食品、冷冻甜点和调味品等多领域的多功能高价值配料。目前，D-阿洛酮糖已在美国、中国和日本等多个市场获得监管批准。
研究方法
2.1 培养基与培养条件
本实验所用培养基为M9培养基。M9培养基由以下组分构成：33.7 mM Na₂HPO₄、22 mM KH₂PO₄、8.6 mM NaCl、9.4 mM NH₄Cl、2 mM MgSO₄、0.1 mM CaCl₂以及A5微量元素混合物。A5混合物提供2.86 mg·L⁻¹ H₃BO₃、1.81 mg·L⁻¹ MnCl₂·4H₂O、0.079 mg·L⁻¹ CuSO₄·5H₂O和49.4 µg·L⁻¹ Co(NO₃)₃·6H₂O。培养基含20 g/L D-葡萄糖和10 g/L酵母提取物。首先将构建的质粒转化至表达优化菌株中。在含相应抗生素的琼脂平板上，筛选具有相应抗性的菌落。随后将选出的菌落接种至含相应抗生素的M9培养基试管中，进行振荡培养。当试管中培养物OD₆₀₀达到约0.6时，加入0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导基因表达。诱导后在30 °C、200 rpm振荡条件下培养72 h。
【数据】培养基：M9（33.7 mM Na₂HPO₄、22 mM KH₂PO₄、8.6 mM NaCl、9.4 mM NH₄Cl、2 mM MgSO₄、0.1 mM CaCl₂、A5微量元素）；碳源：20 g/L D-葡萄糖；氮源/营养：10 g/L酵母提取物；IPTG浓度：0.5 mM；诱导OD₆₀₀：约0.6；诱导温度：30 °C；转速：200 rpm；培养时间：72 h
2.2 重组质粒与菌株的构建
所有质粒构建均在大肠杆菌JM109中进行。相关质粒信息、菌株信息和引物序列分别见表S1、S2和S3。本研究所用全部基因和引物均由GENEWIZ（中国苏州）合成。AlsE基因（GenBank登录号NP_418509.1）使用引物AlsE-F/R从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增，克隆至pETDuet−1，得到pET-AlsE。类似地，PspA6PE（WP_039379501.1）和TtA6PE（WP_013298194.1）基因经组装生成pET-PspA6PE和pET-TtA6PE。pET-AlsE中的原始启动子通过反向PCR使用引物pET-J23119-F/R替换为J23119启动子，得到构建体pET-PJ23119-AlsE。按照相同策略，构建了在五个不同启动子下表达AlsE、PspA6PE和TtA6PE的质粒。采用上述相同策略，构建了基于pCDFDuet−1的质粒，用于在五个不同启动子控制下表达CtA6PP（WP_003512401.1）和HxpB（NP_416241.1）。在这些模板上平行进行反向PCR，使用设计用于替换特定核糖体结合位点（RBS）的引物对。pET-PJ23119-AlsE中的原始RBS（AAGGAG）使用引物pET-J23119-RBS29-AlsE-F和pET-J23119-RBS-AlsE-R替换为RBS29。采用相同方法，使用不同引物组合，构建了含有RBS29（GTTCACACAGGAAACC）、RBS30（GATTAAGAGGAGAAA）、RBS31（GTCACACAGGAAACC）、RBS32（GTCACACAGGAAAG）和RBST7（AAGAAGGAGA）的pET-PJ23119-AlsE和pCD-Ptrc-CtA6PP质粒系列。N23间隔序列使用CRISPR RGEN网站（http://www.rgenome.net/）设计。构建pcrEG质粒所用引物列于表S3。未进行脱靶预测，因为N23间隔序列设计为靶向每个目标基因内的独特序列。具体而言，使用引物pgm-FN23-F/R、pfkA-FN23-F/R、zwf-FN23-F/R和rpiB-FN23-F/R生成pcrEG-pgm、pcrEG-pfkA、pcrEG-zwf和pcrEG-rpiB。包括pgm在内的基因通过pEcCpf1/pcrEG方法使用CRISPR/Cpf1系统敲除。将pEcCpf1质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中以承载CRISPR/Cpf1系统。首先，将细菌培养物培养至OD₆₀₀为0.2。然后，加入30 mM阿拉伯糖诱导λ-Red系统，收获细胞制备电感受态细胞。接着，使用引物Δpgm-UP-F/DH-R通过PCR生成pgm敲除的约500 bp同源臂。将这些同源臂与靶向pgm的N23间隔序列共电穿孔转入细胞。恢复培养后，将细胞涂布于卡那霉素和壮观霉素平板。通过菌落PCR筛选阳性克隆，并通过测序验证。其他基因也采用上述方法敲除。
【数据】质粒宿主：大肠杆菌JM109（构建）、BL21(DE3)（表达）；基因来源：AlsE（GenBank NP_418509.1）、PspA6PE（WP_039379501.1）、TtA6PE（WP_013298194.1）、CtA6PP（WP_003512401.1）、HxpB（NP_416241.1）；载体：pETDuet−1、pCDFDuet−1；启动子：J23119及另外五种；RBS序列：AAGGAG、RBS29（GTTCACACAGGAAACC）、RBS30（GATTAAGAGGAGAAA）、RBS31（GTCACACAGGAAACC）、RBS32（GTCACACAGGAAAG）、RBST7（AAGAAGGAGA）；电转前OD₆₀₀：0.2；阿拉伯糖浓度：30 mM；同源臂长度：约500 bp；抗生素：卡那霉素、壮观霉素
2.3 补料分批培养
在5 L生物反应器（T&J Bioengineering，中国上海）中进行发酵，以进一步验证工程菌株。生物反应器装入2 L M9培养基，额外补充10 g/L酵母提取物，115 °C灭菌30 min，冷却至37 °C后开始培养。接种前用50%（v/v）NH₃·H₂O将培养基pH调节至约6.8，以创造适宜环境。为维持溶解氧在约40%，自动调节搅拌速度。使用火焰法无菌接种10%（v/v）种子培养液。发酵过程中，每2–4 h通过HPLC监测D-葡萄糖浓度。当葡萄糖浓度降至8 g/L以下时，手动补加浓缩葡萄糖溶液（600 g/L），将浓度维持在8–12 g/L范围内。
【数据】生物反应器体积：5 L；工作体积：2 L；酵母提取物补充量：10 g/L；灭菌条件：115 °C、30 min；起始温度：37 °C；pH：约6.8（50% v/v NH₃·H₂O调节）；溶解氧：约40%；接种量：10%（v/v）；葡萄糖监测频率：每2–4 h；补料触发阈值：<8 g/L；补料葡萄糖浓度：600 g/L；维持葡萄糖范围：8–12 g/L
2.4 分析方法
分析时，将最终发酵液离心，上清液过滤制备样品用于胞外代谢物定量。使用分光光度计（METASH，中国上海）在600 nm波长处测定光密度（OD₆₀₀）以监测细胞生长。同时，通过高效液相色谱（HPLC）测定上清液中D-阿洛酮糖和D-葡萄糖的浓度。HPLC分析使用Sugar-Pak™色谱柱（6.5 mm × 300 mm，Waters，美国），柱温维持85 °C，以0.122 mM EDTA-Ca为流动相，流速0.4 mL/min。采用示差折光检测器（RID）进行检测。
【数据】OD测定波长：600 nm；色谱柱：Sugar-Pak™（6.5 mm × 300 mm，Waters）；柱温：85 °C；流动相：0.122 mM EDTA-Ca；流速：0.4 mL/min；检测器：RID
2.5 统计分析
所有实验均进行至少三次独立生物学重复，每次含三个技术重复。数据以平均值±标准差（SD）表示。统计显著性采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验用于多重比较。p值<0.05视为具有统计学显著性。所有统计分析使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software，美国加州圣地亚哥）完成。所有图注已更新，注明误差棒代表三次独立生物学重复的SD，并在结果与讨论部分适当位置添加了统计比较。
【数据】生物学重复：≥3次；技术重复：3次；数据表示：平均值±SD；统计方法：单因素ANOVA + Tukey事后检验；显著性阈值：p<0.05；软件：GraphPad Prism 9.0
研究结果
3.1 在大肠杆菌BL21(DE3)中选择用于D-阿洛酮糖合成的A6PE和A6PP
A6PE催化D-果糖-6-磷酸与D-阿洛酮糖-6-磷酸之间的可逆差向异构化。这两种磷酸化糖随后均可被A6PP去磷酸化，分别生成D-果糖和D-阿洛酮糖。筛选对D-阿洛酮糖-6-磷酸具有更高底物特异性的区域特异性A6PP，对于推动反应平衡向D-阿洛酮糖合成方向移动至关重要。Li等人首次构建了通过D-果糖-6-磷酸将支链淀粉转化为D-阿洛酮糖的体外多酶级联反应。选择合适的A6PE和A6PP酶对提高D-阿洛酮糖产率起着关键作用。值得注意的是，来自热解糖热厌氧杆菌DSM571的A6PE（TtA6PE）表现出优于大肠杆菌A6PE（AlsE）的性能[25]。此外，从多个候选酶中筛选出了一种来自热纤梭菌的A6PP（CtA6PP）。该磷酸酶对D-阿洛酮糖-6-磷酸的特异性显著高于对D-果糖-6-磷酸的特异性。因此，它优先去磷酸化D-阿洛酮糖-6-磷酸生成D-阿洛酮糖，从而有效地将反应平衡拉向目标产物的合成方向[17]。随后为实现D-阿洛酮糖的微生物生产，研究者将A6PE和A6PP引入合适的微生物宿主。该方法被证明是成功的。特别是，Taylor等人证明大肠杆菌具有与A6PE和A6PP对应的内源性酶活性，可支持D-阿洛酮糖的生物合成。他们鉴定出AlsE是负责内源性A6PE活性的关键酶，并进一步确定己糖醇磷酸酶B（HxpB）是将D-阿洛酮糖-6-磷酸去磷酸化生成D-阿洛酮糖的优选磷酸酶[19]。值得注意的是，来自泛菌属的A6PE（PspA6PE）此前也已被用于D-阿洛酮糖生产系统[26]。在本工作中，我们旨在通过引入A6PE和A6PP基因来工程化大肠杆菌BL21(DE3)以生产D-阿洛酮糖（图1）。
为优化体内将D-果糖-6-磷酸转化为D-阿洛酮糖的酶对，我们选择了三种A6PE，即AlsE（GenBank登录号NP_418509.1）、PspA6PE（WP_039379501.1）和TtA6PE（WP_013298194.1），以及两种A6PP，即HxpB（NP_416241.1）和CtA6PP（WP_003512401.1），在宿主中进行组合表达。这些酶从两个独立载体表达：A6PE克隆至pETDuet−1，A6PP克隆至pCDFDuet−1。两种构建体均使用组成型启动子PJ23119和核糖体结合位点（RBS）序列AAGGAG进行初步表达测试。试管培养显示，对照菌株大肠杆菌BL21(DE3)自身在D-葡萄糖基础培养基中产生10 mg/L的D-阿洛酮糖。这证实了该菌株中存在内源性D-阿洛酮糖从头生物合成途径，这一发现与Taylor等人此前的报道一致[19]。相比之下，如图2所示，所有六株共表达不同A6PE/A6PP组合的工程菌株均实现了D-阿洛酮糖产量的显著提升，滴度范围为52至320 mg/L。该结果证实了两个途径基因的功能性表达，并验证了它们在D-阿洛酮糖合成中的关键作用。其中，表达AlsE/CtA6PP组合的菌株BL−02表现最优，达到最高滴度320 mg/L。使用TtA6PE分别与HxpB和CtA6PP配对的菌株BL−05和BL−06产生了中等水平的产量，分别为140和120 mg/L。其余三株菌株产量相对较低，均低于100 mg/L。在此前于55 °C进行的体外多酶生产研究中，热稳定的TtA6PE被鉴定为优势候选酶，在50 °C下表现出132.6 U/mg的比活性[17]。然而，在我们处于中温条件的体内微生物培养系统中，内源性AlsE的表现优于TtA6PE。这一结果表明，热稳定性虽然在体外具有优势，但可能并不直接对应于在中温宿主中的优越性能，提示TtA6PE可能不太适合这种基于培养的特定应用。虽然Taylor等人在大肠杆菌MG1655中通过工程化内源性AlsE/HxpB对，在高细胞密度试管培养条件下实现了15.3 g/L的D-阿洛酮糖产量[19]，但我们的筛选鉴定出CtA6PP是优于HxpB的AlsE搭档。AlsE/CtA6PP组合的优越性能为菌株工程提供了改进的起点。这些初步筛选是在未优化条件下（野生型宿主、无途径敲除、相同启动子和RBS）进行的，因此低滴度代表基线活性。因此，我们选择这一最优酶对作为后续策略的基础，以进一步提高D-阿洛酮糖产量。
【数据】对照菌株D-阿洛酮糖产量：10 mg/L；工程菌株滴度范围：52–320 mg/L；最优菌株BL−02（AlsE/CtA6PP）：320 mg/L；BL−05（TtA6PE/HxpB）：140 mg/L；BL−06（TtA6PE/CtA6PP）：120 mg/L；其余三株：<100 mg/L；TtA6PE比活性：132.6 U/mg（50 °C，文献[17]）；Taylor等人产量：15.3 g/L（文献[19]）；启动子：PJ23119；RBS：AAGGAG
3.2 敲除竞争途径增强D-阿洛酮糖生物合成
D-阿洛酮糖的主要生物合成途径如图1所示，从D-葡萄糖经D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸和D-阿洛酮糖-6-磷酸进行。然而，该途径的产率可能受到若干消耗这些糖磷酸中间体的竞争性代谢途径的限制。具体而言，pgm（编码磷酸葡萄糖变位酶）和zwf（编码D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）分别将D-葡萄糖-6-磷酸导向糖原生物合成和戊糖磷酸途径。同时，pfkA（编码6-磷酸果糖激酶I）将D-果糖-6-磷酸磷酸化为果糖-1,6-二磷酸，使该中间体进入糖酵解。此外，rpiB（编码L-核糖-5-磷酸异构酶B）可将D-阿洛酮糖-6-磷酸转化为D-阿洛糖-6-磷酸，从而将目标中间体导入D-阿洛糖降解途径。为提高D-阿洛酮糖产量，我们在基于AlsE/CtA6PP的菌株BL−02中依次敲除了这四个竞争基因。敲除带来了逐步提高的滴度：去除pgm（菌株BL−07）使D-阿洛酮糖提高25%至402 mg/L；进一步敲除zwf（BL−08）提高至435 mg/L；额外敲除pfkA（BL−09）将产量提升至560 mg/L；最终敲除rpiB（菌株BL−10）达到最大滴度720 mg/L——较亲本菌株BL−02提高2.25倍（图3）。每个基因敲除均使用靶位点侧翼引物通过菌落PCR验证，随后对PCR产物进行测序（图S1）。测序确认所有敲除均正确，未引入非预期突变。过程中未观察到脱靶效应。在大肠杆菌中，pfkB（编码6-磷酸果糖激酶II）和rpiA（编码L-核糖-5-磷酸异构酶A）分别是pfkA和rpiB的同工酶。理论上，敲除这些基因应进一步阻断竞争性糖磷酸消耗并增强D-阿洛酮糖生物合成。具体而言，在我们的工程菌株中敲除pfkB显著损害了D-阿洛酮糖产量，而敲除rpiA未显示增强效果。这些结果表明这些同工酶涉及复杂的功能冗余或未预见到的代谢补偿。若干可能的机制解释可说明这些观察结果。关于pfkB敲除，在pfkA缺陷背景下，额外缺失pfkB可能破坏代谢平衡，导致毒性中间体积累或补偿性反应，使碳流从D-阿洛酮糖合成方向转移。关于rpiA敲除，rpiB主要负责D-阿洛酮糖-6-磷酸的转化，而rpiA主要功能在戊糖磷酸途径中；因此，在rpiB已敲除的情况下，rpiA敲除不带来额外收益。此前，pfkA和pfkB的同时敲除[18,20]，以及选择性……
【数据】亲本菌株BL−02滴度：320 mg/L；BL−07（Δpgm）：402 mg/L（提高25%）；BL−08（ΔpgmΔzwf）：435 mg/L；BL−09（ΔpgmΔzwfΔpfkA）：560 mg/L；BL−10（ΔpgmΔzwfΔpfkAΔrpiB）：720 mg/L（较BL−02提高2.25倍）；敲除基因：pgm、zwf、pfkA、rpiB；验证方法：菌落PCR + 测序
3.3 通过启动子工程对AlsE和CtA6PP进行转录优化
为在转录水平精细调控AlsE和CtA6PP的表达，我们构建了一系列质粒，在五种不同启动子下表达这两个基因（图4A）。图4B显示了不同启动子组合下实现的D-阿洛酮糖滴度。通过系统筛选启动子组合，我们鉴定出最优的转录调控方案，进一步提升了D-阿洛酮糖产量。
【数据】启动子筛选数量：5种；表达基因：AlsE和CtA6PP；具体滴度数据：原文未详述
3.4 通过RBS工程对AlsE和CtA6PP进行翻译优化
在转录优化的基础上，我们进一步通过RBS工程在翻译水平调控AlsE和CtA6PP的表达。构建了含有不同RBS序列的质粒系列（图5A），包括RBS29、RBS30、RBS31、RBS32和RBST7。图5B展示了不同RBS组合下实现的D-阿洛酮糖滴度。通过RBS组合筛选，确定了最优翻译调控方案。
【数据】RBS序列：RBS29（GTTCACACAGGAAACC）、RBS30（GATTAAGAGGAGAAA）、RBS31（GTCACACAGGAAACC）、RBS32（GTCACACAGGAAAG）、RBST7（AAGAAGGAGA）；具体滴度数据：原文未详述
3.5 优化菌株BL−58的补料分批培养
在5 L生物反应器中对优化菌株BL−58进行补料分批培养，以验证其工业规模生产潜力（图6）。发酵过程中通过HPLC每2–4 h监测葡萄糖浓度，当降至8 g/L以下时手动补加600 g/L浓缩葡萄糖溶液，维持浓度在8–12 g/L。最终，优化菌株BL−58在补料分批发酵中实现了33.05 g/L的D-阿洛酮糖产量，D-葡萄糖得率为0.69 g/g。
【数据】生物反应器：5 L；工作体积：2 L；菌株：BL−58；D-阿洛酮糖滴度：33.05 g/L；得率：0.69 g/g D-葡萄糖消耗；补料葡萄糖浓度：600 g/L；维持葡萄糖范围：8–12 g/L；监测频率：每2–4 h
讨论与解读
本研究在大肠杆菌BL21(DE3)中成功构建了D-阿洛酮糖的磷酸化/差向异构化/去磷酸化合成途径。通过筛选最优酶对（AlsE/CtA6PP）、依次敲除四个竞争途径基因（pgm、zwf、pfkA、rpiB），以及启动子和RBS工程在转录和翻译两个水平精细调控表达，最终优化菌株BL−58在试管培养中产量达5.26 g/L，补料分批发酵中达33.05 g/L，得率为0.69 g/g D-葡萄糖消耗。值得注意的是，内源性AlsE在中温体内条件下优于热稳定的TtA6PE，提示体外酶学特性不能直接预测体内表现。pfkB和rpiA同工酶敲除的负面或中性结果揭示了代谢网络的复杂补偿机制。
编译者解读：该研究的方法论价值在于将酶筛选、途径阻断与表达调控整合为系统性优化策略。选择磷酸化/差向异构化/去磷酸化路线避开了传统差向异构化的热力学限制，得率0.69 g/g已接近理论值。但研究止步于摇瓶和5 L反应器验证，未涉及下游分离纯化；此外，pfkB敲除的负面效应提示碳流重定向的机制尚需¹³C代谢通量分析加以阐明。总体而言，该工作为D-阿洛酮糖的微生物法生产提供了可借鉴的代谢工程范式。
参考来源
期刊：Enzyme and Microbial Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110929
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110929