来源：Biosynthesis and characterization of Streptomyces-derived silver/silver oxide nanoparticles and their antimicrobial, insecticidal, and tomato Fusarium wilt suppression activities（Physiological and Molecular Plant Pathology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
从阿尔及利亚赛伊达森林土壤中分离到一株放线菌V003，经16S rRNA测序鉴定为链霉菌属。研究者利用其无细胞上清液和次级代谢产物，在温和条件下合成了银/氧化银纳米复合物（Ag/AgO NPs），并系统表征了其理化性质。该纳米颗粒对多种细菌、酵母和真菌具有抗菌活性，对蚕豆蚜表现出杀虫效果，还能在温室条件下保护番茄抵抗尖孢镰刀菌。研究进一步通过LC-MS鉴定出灵菌红素和壮观链菌素衍生物参与了纳米颗粒的形成。
研究背景
纳米技术已迅速成为前沿研究领域，纳米颗粒因尺寸微小而具备高比表面积和增强的磁学特性，在医药和农业中展现出广阔前景。金属及金属氧化物纳米颗粒是研究最深入的一类，但传统合成方法往往条件苛刻、成本高昂且对环境有害。绿色合成——尤其是利用细菌合成银纳米颗粒——因低成本、环境友好、无有毒副产物而受到关注。放线菌中的链霉菌因能产生丰富的次级代谢产物，被认为是纳米颗粒生物合成的理想候选者。本研究从森林土壤中分离链霉菌V003，利用其代谢产物合成Ag/AgO纳米复合物，并评估其抗菌、抗氧化、杀虫及抗植物病原真菌的潜力。
研究方法
2.1 土壤采样点
样品采自阿尔及利亚西部赛伊达镇的赛伊达森林（34.816730, 0.156981）。土壤取自森林内河岸的沉积区域。土壤清理后经风干、粉碎，置于塑料容器中保存。
【数据】采样地点：赛伊达森林（34.816730, 0.156981）；土壤类型：河岸沉积区土壤；原文未详述保存温度
2.2 放线菌的分离、表征及16S rRNA分析
采用梯度稀释法从土壤样品中分离放线菌。将1克土壤样品溶于9 mL无菌蒸馏水中制成10⁻¹（1:10）稀释液，随后梯度稀释至10⁻⁴，每个稀释度取0.1 mL涂布于含萘啶酸（20 mg L⁻¹）和制霉菌素（50 mg L⁻¹）的淀粉酪蛋白硝酸盐（SCN）琼脂上。平板在30 °C下培养10天。分离得到的菌落划线接种于GYM琼脂，并保存于−80 °C的50%甘油中。利用ISP培养基及相关培养基进行生理生化表征。培养15天后，在30 °C下使用ISCC-NBS色卡记录菌落形态、气生菌丝和色素产生情况。评估温度（5–40 °C）、pH（4–12）和NaCl浓度（0–10%）范围内的生长情况。碳源利用和酶活性采用标准培养基和API试剂盒评估。在ISP3培养基上生长后，通过扫描电子显微镜进一步检查形态特征。使用商业试剂盒提取基因组DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳验证。使用通用引物27F和1492R在热循环仪中扩增16S rRNA基因。PCR产物经纯化、测序后用Geneious软件编辑。使用EzTaxon-e数据库确定序列相似性。使用MEGA 6软件以邻接法和最大似然法进行系统发育分析。通过自举分析（1000次重复）评估树的可靠性，使用Kimura双参数模型计算进化距离。
【数据】土壤用量：1 g；稀释液体积：9 mL；稀释梯度：10⁻¹至10⁻⁴；涂布量：0.1 mL；萘啶酸浓度：20 mg L⁻¹；制霉菌素浓度：50 mg L⁻¹；培养温度：30 °C；培养时间：10天；保存温度：−80 °C；甘油浓度：50%；温度范围：5–40 °C；pH范围：4–12；NaCl浓度范围：0–10%；自举重复次数：1000
2.3 次级代谢产物的提取
次级代谢产物的提取通过将等体积（各20 mL）的细菌培养液与乙酸乙酯（Sigma-Aldrich，美国）混合实现。混合物振荡12分钟，随后在9000 rpm下离心10分钟以促进相分离。分离有机层，使用旋转蒸发仪（Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach, 德国）在减压条件下除去溶剂。干燥提取物产量为15 mg固体（0.75 mg/mL培养液；0.075% w/v），溶于1 mL甲醇中得到浓度为15 mg/mL的储备液。
【数据】培养液体积：20 mL；乙酸乙酯体积：20 mL；振荡时间：12 min；离心转速：9000 rpm；离心时间：10 min；提取物产量：15 mg；浓度：0.75 mg/mL培养液（0.075% w/v）；储备液浓度：15 mg/mL；溶剂：甲醇
2.4 次级代谢产物的LC-MS分析
使用HPLC和LC-MS对放线菌粗提物中的次级代谢产物进行筛选。首先使用Agilent 1100 HPLC系统进行分级，该系统配有C18柱（2.1 × 100 mm, 3.5 μm）和二极管阵列检测器（200–400 nm）。溶剂系统由两种洗脱缓冲液组成：EB1（水与乙腈的混合物，含甘氨酸和乙酸）和EB2（富含乙腈及另外两种成分）。运行40分钟后，将馏分收集到96孔板中（每孔150 μL），并根据色谱峰进行分级。馏分在40 °C下用氮气蒸干，同时加入150 μL含标准化微生物接种物（0.01麦氏浊度）的无菌营养肉汤。在37 °C下孵育24–48小时后测定生长抑制情况。主要通过目视浊度判断，与浑浊的阴性对照孔相比，无浊度表明显著抑制。为精确起见，通过酶标仪在OD 600 nm处测量确定阳性命中；抑制率以相对于阴性对照的吸光度百分比差异估算。抑制率超过80%的馏分标记为“高活性”，并进一步与相应色谱峰关联以检测潜在生物活性物质。随后使用Agilent 1200 LC系统与Bruker Daltonics的maXis UHR-TOF质谱仪进行结构鉴定。分离使用C18 UPLC柱（2.1 × 50 mm, 1.7 μm），以水和乙腈（各含0.1%甲酸）梯度洗脱，流速0.6 mL min⁻¹。数据采集按照放线菌代谢物分析的标准程序进行。
【数据】C18柱规格：2.1 × 100 mm, 3.5 μm；检测波长：200–400 nm；运行时间：40 min；每孔体积：150 μL；接种物浊度：0.01麦氏浊度；孵育温度：37 °C；孵育时间：24–48 h；抑制率阈值：>80%；UPLC柱规格：2.1 × 50 mm, 1.7 μm；流速：0.6 mL min⁻¹；甲酸浓度：0.1%
2.5 银纳米颗粒的生物合成
Ag/AgO NPs采用生物还原方法合成。反应混合物由100 mL 1 mM AgNO₃（Sigma-Aldrich，纯度≥99.0%）作为金属离子来源、50 mL无细胞上清液（来自在5294培养基中生长10天的链霉菌培养物）和1 mL粗次级代谢产物组成。用0.1 M NaOH将溶液pH调至8.5，以调整代谢物的电离状态以利于还原过程。反应在黑暗中30 °C下孵育60小时，以避免银离子的过早光还原。阴性对照以无菌去离子水替代无细胞上清液和粗提物。生物合成后的混合物经历37 °C、180 rpm旋转6天的成熟阶段。此孵育旨在确保所有Ag⁺完全还原且封端层正确形成。Ag/AgO NPs的形成通过紫外-可见分光光度法确认和监测。
【数据】AgNO₃浓度：1 mM；AgNO₃体积：100 mL；AgNO₃纯度：≥99.0%；无细胞上清液体积：50 mL；培养物龄期：10天；粗代谢物体积：1 mL；pH：8.5；NaOH浓度：0.1 M；孵育温度：30 °C；孵育时间：60 h；成熟温度：37 °C；成熟转速：180 rpm；成熟时间：6天
2.6 Ag/AgO NPs的表征
AgNO₃前体的生物还原通过紫外-可见光谱分析生物合成的银纳米颗粒来确认。分析使用双光束分光光度计，分辨率1 nm。在200至1100 nm波长范围内采集UV-Vis光谱。傅里叶变换红外光谱（FTIR）用于探究Ag/AgO NPs的FTIR光谱，分析以漫反射模式进行，分辨率4 cm⁻¹。AgNPs的光谱记录范围为4000 cm⁻¹至400 cm⁻¹。使用配备Cu-Kα辐射（λKα1 = 1.5406 Å）的衍射仪，2θ = 0.5°–130°，增量Δ2ϑ: 0.034°，分析500 mg Ag/AgO NPs粉末。电压设为45 kV，电流设为40 mA。功率调整为1.6 kW，计数时间0.5 s/步。收集的数据使用OriginPro分析，峰与物理化学分析研究中心（RCPCA）数据库中的标准Ag/AgO NPs值进行比较。纳米颗粒尺寸通过Debye-Scherrer公式确定：D = Kλ / β cosθ，其中D为平均微晶尺寸（nm），K为形状因子（0.9），λ为Cu Kα辐射波长（0.15406 nm），β为衍射峰的半高全宽（FWHM，弧度），θ为Bragg衍射角。微晶尺寸基于XRD图谱中最强峰确定。使用Malvern Zetasizer Nano-ZS90测定Ag/AgO NPs的Zeta电位。样品重悬于pH 7.4的5 mM磷酸盐缓冲溶液中。然后在电泳池中评估电泳迁移率。Zeta电位计算时样品测试三次。Ag/AgO NPs的尺寸和结构通过场发射扫描电子显微镜（SEM）评估，操作电压5 kV。简言之，将0.001 g样品施加于碳条上制成Ag/AgO NPs薄膜。在不同放大倍数下记录表面图像。使用ImageJ软件确定尺寸。
【数据】UV-Vis分辨率：1 nm；波长范围：200–1100 nm；FTIR分辨率：4 cm⁻¹；FTIR范围：4000–400 cm⁻¹；XRD 2θ范围：0.5°–130°；增量：0.034°；样品量：500 mg；电压：45 kV；电流：40 mA；功率：1.6 kW；计数时间：0.5 s/步；Cu Kα波长：0.15406 nm；形状因子K：0.9；缓冲液浓度：5 mM；缓冲液pH：7.4；SEM操作电压：5 kV；SEM样品量：0.001 g；Zeta电位测试次数：3
研究结果
3.1 特定分离菌株的选择
使用SCNA培养基共获得约54株不同分离物。这些分离物以其典型的放线菌形态特征加以区分，编号从V000至V053，并保存于−80 °C的50%甘油溶液中。本研究仅选择了一株分离物V003，因其具有显著的培养特性，提示其可能产生灵菌红素。
【数据】分离物数量：约54株；编号范围：V000–V053；保存温度：−80 °C；甘油浓度：50%
3.2 V003的表型特征
分离物V003被鉴定为革兰氏阳性、好氧细菌，在琼脂培养基上具有广泛菌丝生长。气生菌丝显示出与链霉菌属常见的显著特征。SEM提供了该分离物结构的详细图像，突出了与其菌落形成相关的若干特征。气生菌丝由成熟孢子组成，排列成长而直、柔韧的链。这些孢子类似长杆状，表面坚硬且不运动。完全分隔的气生链导致成熟孢子的分散，如图1g所示。分离物V003在GYM、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP7、SSM + T和SSM-T培养基上表现出旺盛生长，而在ISP6培养基上生长中等。气生菌丝颜色从鲑鱼橙色变为红紫色。值得注意的是，仅在SSM + T培养基上检测到可溶性色素。补充表1和图1（a, b, c）展示了V003气生菌丝在ISP系列培养基上的生长模式和颜色。V003菌丝生长的最适条件为30 °C和pH 7.0。该分离物在含2.5%和5% NaCl的环境中生长良好，并具有利用多种碳水化合物作为唯一碳源的遗传能力（补充表2和图1d, e）。Api Zym®和Coryne®显示V003具有显著的酶活性。该分离物对七叶苷（β-葡萄糖苷酶）、胰蛋白酶、糜蛋白酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、亮氨酸芳基酰胺酶、β-半乳糖苷酶、吡咯烷酮基芳基酰胺酶、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶、缬氨酸芳基酰胺酶和α-甘露糖苷酶表现出高活性（补充表3和图1f）。
【数据】最适生长温度：30 °C；最适pH：7.0；耐NaCl浓度：2.5%和5%；培养基：GYM、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP7、SSM + T、SSM-T（旺盛生长），ISP6（中等生长）；气生菌丝颜色：鲑鱼橙色至红紫色；可溶性色素：仅在SSM + T培养基检测到
3.3 V003的16S rRNA序列分析
在EzTaxon-e数据库中分析V003的16S rRNA基因后，结果表明该细菌分离物应归类为链霉菌属。V003的16S rRNA基因序列包含1493个碱基对（bp）；与Streptomyces flavofungini NBRC 13371(T)的相似性为99.10%（13/1444 bp），与Streptomyces silaceus NRRL B-24166(T)的相似性为98.89%（15/1446 bp）。如图2所示，最大似然系统发育分析支持这些发现。分离物V003的16S rRNA基因序列保藏号为MH298059。
【数据】16S rRNA基因序列长度：1493 bp；与S. flavofungini NBRC 13371(T)相似性：99.10%（13/1444 bp）；与S. silaceus NRRL B-24166(T)相似性：98.89%（15/1446 bp）；保藏号：MH298059
3.4 Ag/AgO NPs的合成
通过细菌和次级代谢产物生物合成Ag/AgO NPs是环境友好的，与化学和物理方法相比具有多种优势，如安全性、成本效益和大规模生产。细菌，尤其是链霉菌等放线菌，因其能产生多种对纳米颗粒形成至关重要的次级代谢产物而被广泛研究。本研究涉及鉴定从土壤链霉菌菌株中分离的次级代谢产物，并评估其作为Ag/AgO NPs合成催化剂的效力，其中银离子（Ag⁺）被还原为金属银（Ag⁰）。纳米颗粒的存在首先通过颜色从深粉色变为深棕色（由于表面等离子体共振，SPR）来确认。Ag/AgO NPs的合成也通过200至1100 nm波长范围的UV-Vis光谱确认。如图3所示，在440 nm处出现吸收峰，这是与生物合成Ag/AgO NPs相关的SPR效应的特征。早期关于Ag/AgO NPs合成的文献记录了SPR效应出现在420至450 nm波长范围内。因此可以得出结论，Ag⁺离子通过放线菌代谢物的参与成功还原形成了Ag/AgO NPs。然而，观察到的SPR效应波长的轻微偏差可能是由于它们作为封端和稳定剂的参与。
【数据】SPR吸收峰：440 nm；波长扫描范围：200–1100 nm；文献SPR范围：420–450 nm；颜色变化：深粉色→深棕色
3.5 XRD分析
X射线衍射用于确定晶体尺寸、测量晶格参数和识别原子排列。它是分析NPs晶体结构的关键方法。本研究反应后获得的Ag/AgO NPs的XRD图谱如图4A所示。存在的八个峰具有不同强度。衍射角27.82°和32.23°分别对应（100）和（111）面，与JCPDS参考（01–076-1489）一致，验证了氧化银纳米颗粒的特征。Ag纳米颗粒的特征由2θ° = 38.13°、44.30°、64.49°、77.43°和81.53°处的衍射峰验证，分别对应（111）、（200）、（220）、（311）和（222）面。当前发现与Sherpa等人和Ali等人的结果一致，他们发现从衍射峰获得的d间距为2.36 Å、2.05 Å、1.45 Å和1.236 Å，分别对应fcc Ag晶体的（111）、（200）、（220）和（311）面。结果表明Ag/AgO NPs已成功合成，符合JCPDS参考（00-001-1167）。Ag/AgO纳米颗粒中微晶的尺寸使用Debye-Scherrer方程基于Bragg反射半高宽测量。微晶尺寸见表1。
【数据】衍射角：27.82°（100）、32.23°（111）、38.13°（111）、44.30°（200）、64.49°（220）、77.43°（311）、81.53°（222）；JCPDS参考：01–076-1489（氧化银）、00-001-1167（银）；d间距：2.36 Å（111）、2.05 Å（200）、1.45 Å（220）、1.236 Å（311）；峰数：8个
3.6 FTIR分析
作为Ag/AgO NPs封端剂的次级代谢产物的官能团通过FTIR分析进行分析和鉴定。官能团在将纳米颗粒溶解于水溶液时也发挥另一重要作用，因为它们稳定还原的银纳米颗粒并防止其聚集。在4000–400 cm⁻¹范围内的FTIR扫描数据中记录了若干峰，如图4B所示。图谱显示在3394、2898、1686、1323和576 cm⁻¹处出现多个显著和轻微的吸收带位移，表明存在参与Ag/AgO NPs稳定的试剂。Ag/AgO NPs的FTIR分析显示1686 cm⁻¹处的峰与酰胺的C=O基团相关。该峰主要归因于羧基伸缩振动和N–H变形振动。纳米颗粒的封端和稳定归因于该酰胺峰的存在，表明涉及含有N-H键的蛋白质或其他物质。此外，N–H、C–H和C–H伸缩振动分别由3394 cm⁻¹和2898 cm⁻¹处观察到的峰佐证。1323 cm⁻¹处的谱带归因于C–C和C–N伸缩振动。Ag/AgO NPs的还原、稳定和封端与这些官能团密切相关。
【数据】FTIR峰位置：3394、2898、1686、1323、576 cm⁻¹；扫描范围：4000–400 cm⁻¹；1686 cm⁻¹归属：酰胺C=O；3394 cm⁻¹归属：N–H伸缩；2898 cm⁻¹归属：C–H伸缩；1323 cm⁻¹归属：C–C和C–N伸缩
3.7 SEM分析
代表性SEM图像证实了Ag/AgO NPs的绿色合成。生物合成过程中使用的浓度促进了主要均匀的小尺寸Ag/AgO NPs群体的形成。观察到各种立方形状的颗粒，尺寸范围为10至40 nm（图4C）。这些结果与Sherpa等人一致，他们生产了尺寸在13至24 nm之间的球形和多孔Ag/AgO NPs。
【数据】颗粒尺寸：10–40 nm；形状：立方体为主；文献对照尺寸：13–24 nm
3.8 Zeta电位
纳米颗粒的电荷性质在其排斥（库仑排斥）和防止团聚中起重要作用。该物理参数与纳米颗粒的净表面电荷相关，通过测量Zp来评估。Ag/AgO NPs的稳定性与Zp密切相关，Zp范围为0 mV至−30 mV。合成的Ag/AgO NPs表现出约−2的Zeta电位。
【数据】Zeta电位范围：0至−30 mV；实测Zeta电位：约−2 mV
3.9 次级代谢产物鉴定
对活性馏分的LC-MS分析表明，灵菌红素和壮观链菌素衍生物参与了纳米颗粒的形成。HPLC分级色谱图（图5A）和LC-MS色谱图（图5B）展示了提取物Ext5254.V003的分离和鉴定结果。
【数据】活性化合物：灵菌红素和壮观链菌素衍生物；提取物编号：Ext5254.V003
3.10 抗氧化活性
Ext5254.V003和Ag/AgO NPs的抗氧化活性通过DPPH自由基清除试验（图6A）和ABTS自由基清除试验（图6B）评估。数值代表三次重复的平均值及标准差（±SD）。同一柱中不同字母表示在p < 0.05水平上差异显著。
【数据】试验方法：DPPH和ABTS自由基清除试验；重复次数：3；显著性水平：p < 0.05
3.11 杀虫活性
暴露于植物提取物（Ext5254.V003）和Ag/AgO NPs在不同浓度（1、1.5和2 mg mL⁻¹）下39小时的昆虫死亡率（%）如图7所示。数据以平均值±平均标准误（SE）表示（n = 3）。整个实验过程中对照处理未观察到死亡率。
【数据】测试浓度：1、1.5、2 mg mL⁻¹；暴露时间：39 h；重复次数：3；对照死亡率：0
3.12 对番茄种子萌发和幼苗生长的影响
不同浓度Ag/AgO NPs对番茄种子萌发（图8A-C）、番茄幼苗茎和根长度（图8D）、叶片数（图8E）以及生长15天后番茄幼苗干重和鲜重（图8F）的影响如图8所示。数值代表三次重复的平均值。
【数据】生长时间：15天；重复次数：3；测试指标：种子萌发、茎和根长度、叶片数、干重、鲜重
3.13 对番茄枯萎病的抑制
Ag/AgO NPs对番茄幼苗中F. oxysporum生长的抑制作用如图9所示。数值代表三次重复的平均值及标准误（±SE）。同一柱中不同字母表示根据Tukey's HSD检验在p < 0.05水平上差异显著。在温室实验中，100 μg mL⁻¹剂量的Ag/AgO NPs保护了番茄植株抵抗F. oxysporum。
【数据】有效剂量：100 μg mL⁻¹；重复次数：3；显著性检验：Tukey's HSD，p < 0.05；实验条件：温室
讨论与解读
本研究证明链霉菌V003产生的次级代谢产物——尤其是灵菌红素及其衍生物——可作为立方状Ag/AgO纳米复合物形成的有效还原剂和稳定剂。体外实验表明，这些Ag/AgO纳米颗粒作为抗菌、抗真菌、杀虫和抗氧化材料具有前景。它们对镰刀菌和蚕豆蚜的效果提示其在植物病害和害虫管理中的潜在应用。然而，上述结果应视为初步的，受限于当前实验室规模研究的局限性。潜在生物活性受Ag/AgO纳米复合物化学组成的影响，需要进一步研究以确定其与其他化合物相互作用的精确机制。后续工作需解决合成工艺的放大、田间条件下的验证以及环境毒性评估。研究的第一个局限性在于仅使用表型特征和16S rRNA基因序列进行物种水平鉴定。尽管这两种方法常用于生物分类鉴定，但使用化学分类学和基因组技术（包括全基因组测序和ANI比较）将进一步增强分类分辨率。
编译者解读：该研究展示了一条从土壤放线菌到多功能纳米材料的完整技术路线，其亮点在于利用链霉菌次级代谢产物同时充当还原剂和封端剂，避免了额外化学还原剂的添加。灵菌红素和壮观链菌素衍生物的鉴定为理解生物合成机制提供了分子线索。不过，Zeta电位仅约−2 mV，暗示纳米颗粒分散稳定性有限，这可能制约其实际应用中的货架期和田间效果。此外，研究停留在温室规模，从实验室到田间的放大过程中，纳米颗粒的团聚、土壤吸附和生态毒性都是不可回避的工程问题。抗菌谱虽广，但缺乏对具体作用靶点和耐药性风险的深入分析。
参考来源
期刊：Physiological and Molecular Plant Pathology, 2026
DOI: 10.1016/j.pmpp.2026.103359
DOI: 10.1016/j.pmpp.2026.103359