来源：The cellulose synthase, AgCESA5, induces cellulose biosynthesis during cell walls formation in celery（Journal of Plant Physiology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
芹菜（Apium graveolens L.）是伞形科重要的绿叶蔬菜，其细胞壁富含纤维素，而纤维素是膳食纤维的主要成分及糖化反应的核心底物。本研究从五个芹菜品种中系统鉴定了AgCESA基因家族，发现AgCESA5在芹菜叶柄纤维素积累中发挥正调控作用。通过同源过表达、亚细胞定位、酵母单杂交及双荧光素酶报告实验，研究证实两个R2R3-MYB转录因子AgMYB59和AgMYB6可直接结合AgCESA5启动子并激活其表达。该发现为理解芹菜纤维素合成的转录调控网络提供了新证据，也为通过基因工程手段定向改良芹菜口感与营养品质奠定了分子基础。
研究背景
芹菜（Apium graveolens L.）是伞形科二年生草本植物，其叶片及叶柄的机械强度对产量和品质有重要影响。细胞壁是叶柄机械支撑的主要结构组分，为植株维持直立姿态提供刚性，同时保护细胞免受非生物与生物胁迫。高等植物细胞壁分为初生壁（PCWs）和次生壁（SCWs）：薄壁细胞仅含初生壁，分化程度低，特定条件下可转分化为特化细胞类型；芹菜初生壁主要由纤维素、果胶多糖和半纤维素等构成。次生壁通常沉积于木质部等具机械支持与运输功能的特化细胞中，含纤维素（40%～60%）、半纤维素（10%～40%）、木质素（5%～25%）及蛋白质。纤维素是两类细胞壁共有的关键结构组分，为细胞提供机械支撑，也是膳食纤维的核心成分。适度纤维素积累可提升芹菜营养品质，但过量沉积会降低叶柄嫩度和口感。因此，解析调控芹菜纤维素积累的分子因子，对通过基因工程精准调控芹菜品质具有重要意义。
研究方法
2.1 植物材料与生长条件
选取具有不同叶柄颜色和髓部形态（空心与实心）的主要商业芹菜品种进行纤维素积累的比较分析，包括白芹‘赛雪（SX）’、紫芹‘紫秆一号（ZG1H）’、绿芹‘四季芹菜（SJQC）’、‘津南实芹（Q2）’以及黄色空心芹‘黄太极（HTJ）’。所有植株种植于作物遗传与种质创新利用全国重点实验室人工气候室（32°03′N，118°84′E）内装有土壤-蛭石混合物的花盆中。生长条件维持为25°C/18°C（昼/夜），光周期16小时/8小时，白天光照强度300 μmol m⁻² s⁻¹，相对湿度75%。分别于发芽后70天和100天采集芹菜叶柄用于后续分析。
【数据】品种：SX、ZG1H、SJQC、HTJ、Q2；温度：25°C/18°C（昼/夜）；光周期：16h/8h；光照强度：300 μmol m⁻² s⁻¹；相对湿度：75%；采样时间：70和100 DAG
2.2 RNA提取、cDNA合成与gDNA提取
分别从五个芹菜品种（‘SX’、‘ZG1H’、‘SJQC’、‘HTJ’、‘Q2’）70和100 DAG采集的叶柄以及100 DAG转基因芹菜株系叶柄中提取总RNA。RNA提取使用RNA simple Total RNA Kit（DP419）（天根，北京）并按制造商说明书操作。cDNA通过Prime Script RT reagent Kit（RR037A）（Takara，大连）逆转录合成。gDNA使用DNA secure Plant Kit（DP320）（天根，北京）从相同芹菜样品中提取。RT-qPCR分析中，使用Primer Premier 6.0设计靶向AgCESA基因及其他纤维素生物合成相关基因的特异性引物，所有引物序列列于表S1。以AgTUB基因作为内参。RT-qPCR在CFX96实时荧光定量PCR检测系统（Bio-Rad）上使用SYBR Premix Ex Taq（Takara，大连）进行。相对基因表达水平采用2⁻ΔΔCt方法定量，每个样品设三个生物学重复。每对引物的特异性通过Bioedit软件针对芹菜全基因组数据库进行局部BLAST搜索验证，仅保留与目标AgCESA基因完全匹配且无高相似性脱靶位点的引物用于后续实验。
【数据】RNA提取试剂盒：DP419（天根）；cDNA合成试剂盒：RR037A（Takara）；gDNA提取试剂盒：DP320（天根）；内参基因：AgTUB；定量方法：2⁻ΔΔCt；生物学重复：3个
2.3 纤维素与可溶性糖含量测定
纤维素含量按先前描述的方法测定。简要流程如下：芹菜叶柄用液氮研磨成粉末，室温风干。取约30 mg干燥粉末转移至10 mL试管中，加入2 mL乙酸:硝酸:蒸馏水（8:2:1，v/v）混合液，煮沸1小时，每10分钟摇动一次。3000g离心5分钟后弃上清，沉淀用蒸馏水洗涤至中性pH。随后加入1 mL 67%硫酸，150 r/min摇动1小时，用蒸馏水定容至10 mL。取0.2 mL制备液转移至2 mL试管中，与0.05 mL 2%蒽酮试剂和0.5 mL浓硫酸混合。最后每管取200 μL反应液转移至微孔板，使用Spectramax微孔板读数仪在620 nm波长处测定吸光度。芹菜叶柄可溶性糖含量使用植物可溶性糖含量试剂盒（科铭，苏州）（KT-2-Y）测定。每个样品设三个生物学重复。
【数据】样品量：约30 mg；乙酸:硝酸:蒸馏水=8:2:1（v/v）；煮沸时间：1h；离心：3000g，5min；硫酸浓度：67%；摇动：150 r/min，1h；蒽酮试剂浓度：2%；检测波长：620nm；生物学重复：3个
2.4 AgCESA生物信息学分析
从芹菜基因组和转录组数据库中检索推定的AgCESA基因序列。使用DNAMAN 8.0软件进行AgCESA蛋白氨基酸序列比对。AgCESA基因外显子和内含子结构使用Gene Structure Display Server（GSDS v2.0，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）分析。拟南芥和水稻CESA蛋白序列从NCBI数据库下载。使用MEGA 7.0软件对AgCESA、AtCESA和OsCESA氨基酸序列进行多重序列比对，基于比对结果构建邻接（NJ）系统发育树，bootstrap值由1000次重复计算。BioXM软件用于预测AgCESA基因开放阅读框（ORF）、将编码核苷酸序列翻译为氨基酸序列并计算序列长度。
【数据】系统发育树构建方法：邻接法（NJ）；bootstrap重复数：1000
2.5 亚细胞定位分析
使用特异性引物扩增AgCESA5、AgMYB6和AgMYB59的全长ORF（不含终止密码子），分别插入pSPYE载体，构建CaMV 35S:AgCESA5-EGFP、CaMV 35S:AgMYB6-EGFP和CaMV 35S:AgMYB59-EGFP融合载体。重组载体通过农杆菌介导的瞬时表达系统导入本氏烟叶片。孵育48小时后，在Zeiss LSM 780共聚焦激光扫描显微镜下检测增强绿色荧光蛋白（EGFP）荧光信号，EGFP激发波长为488 nm。细胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染，DAPI在405 nm激发，发射特征蓝色荧光。
【数据】载体：pSPYE；激发波长：EGFP 488nm，DAPI 405nm；孵育时间：48h
2.6 过表达载体构建与芹菜遗传转化
从芹菜‘Q2’中扩增AgCESA5全长ORF，克隆至含有β-葡萄糖苷酸酶（GUS）报告基因的G2300-35S-NOS载体中。重组载体（35S:AgCESA5:GUS）通过电穿孔法导入农杆菌菌株GV3101，随后转化‘Q2’。芹菜遗传转化按先前描述方法进行。阳性转基因株系通过GUS染色和PCR扩增（30个循环）鉴定——使用载体特异性引物AgCESA5-G2300-F和G2300-35S-NOS对100 DAG芹菜叶柄进行检测，所有引物序列列于表S1。
【数据】农杆菌菌株：GV3101；PCR循环数：30；转化材料：芹菜品种‘Q2’
2.7 解剖结构分析
100 DAG时，取最长叶柄的五分之一节段制备新鲜横切面，对照和转基因芹菜各使用3株独立植株。样品浸入含2.5%戊二醛的磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中，4°C保存。番红O/固绿染色按Que等人描述的方法进行以观察细胞形态。制备切片的组织学图像使用Olympus BX-53显微镜（Olympus，东京，日本）拍摄。
【数据】固定液：2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液（pH 7.2）；温度：4°C；植株数：3株/株系
2.8 AgCESA5启动子克隆与顺式元件分析
从芹菜基因组数据库获得AgCESA5启动子序列（2017 bp）。使用特异性引物从‘Q2’gDNA中克隆全长启动子。测序验证后，使用PlantCARE在线工具分析启动子区域的顺式作用元件。
【数据】启动子长度：2017bp
2.9 pAgCESA5-ABAi的构建、转化与自激活检测
从‘Q2’gDNA中扩增含有推定MYB结合位点（MYB顺式元件）的AgCESA5启动子片段（600 bp）。PCR产物插入pABAi载体的Hind III和Sal I限制性酶切位点之间，获得诱饵构建体pAgCESA5-ABAi。pAgCESA5-ABAi按Y1H Gold化学感受态细胞（韦迪，上海）制造商说明书转化酵母菌株Y1H Gold。转化酵母涂布于SD/Ura⁻培养基，30°C培养3天，选择阳性克隆。
【数据】启动子片段长度：600bp；限制性酶切位点：Hind III和Sal I；酵母菌株：Y1H Gold；培养基：SD/Ura⁻；温度：30°C；时间：3d
研究结果
3.1 五个芹菜品种70/100 DAG叶柄纤维素含量比较及AgCESA基因家族鉴定
100 DAG时，五个品种的芹菜植株株高均大于70 DAG（图1A）。对两个时间点采集的叶柄样品进行纤维素含量定量。总体而言，芹菜叶柄纤维素含量在100 DAG时均高于70 DAG。所有样品中，‘HTJ’在100 DAG时表现出最高纤维素含量（24.98 g/100 g DW），而‘ZG1H’在70 DAG时含量最低（6.70 g/100 g DW）（图1B）。
为进一步阐明不同芹菜品种叶柄纤维素积累差异的分子基础，系统鉴定了芹菜AgCESA基因家族成员。共鉴定出9个AgCESA基因，命名为AgCESA1至AgCESA9。推导氨基酸序列的多重比对显示，所有AgCESA蛋白均含有保守的糖基转移酶特征基序（D、D、D、QxxRW），该基序对UDP-葡萄糖结合至关重要，家族成员间氨基酸序列整体一致性为57.21%（图1C）。对芹菜、拟南芥和水稻CESA蛋白的系统发育分析表明：AgCESA1与AtCESA1/10紧密聚类；AgCESA2、AgCESA6和AgCESA9形成紧密相关亚组；AgCESA3和AgCESA4分别与AtCESA3和AtCESA4同源；AgCESA5与OsCESA3/5/6高度相似；AgCESA7和AgCESA8分别与OsCESA11和AtCESA8密切相关（图1D）。基因结构分析显示外显子-内含子组织存在差异：AgCESA1/2/3/6/8各含14个外显子和13个内含子，AgCESA4/7含12个外显子和11个内含子，而AgCESA5/9外显子和内含子数量最少，仅含7个外显子和6个内含子（图1E）。
【数据】最高纤维素含量：HTJ在100 DAG为24.98 g/100g DW；最低纤维素含量：ZG1H在70 DAG为6.70 g/100g DW；AgCESA基因数量：9个；氨基酸序列一致性：57.21%；AgCESA5/9外显子/内含子：7/6
3.2 五个芹菜品种70/100 DAG叶柄AgCESA基因表达分析及AgCESA5亚细胞定位
AgCESA2、AgCESA5和AgCESA7的相对表达水平表现出与纤维素积累相似的趋势。芹菜叶柄中AgCESA2、AgCESA5和AgCESA7的相对表达水平在100 DAG时高于70 DAG（图2A）。相比之下，AgCESA9的相对表达在70 DAG时高于100 DAG。纤维素含量越高，AgCESA5相对表达水平越高。在‘HTJ’叶柄中，AgCESA5相对表达水平和纤维素含量在100 DAG时分别为70 DAG时的88倍和1.25倍。‘ZG1H’70 DAG叶柄中AgCESA5表达和纤维素含量均为最低。
芹菜叶柄中纤维素含量与AgCESA基因表达水平的相关性分析见表S2。AgCESA5的相对表达水平与纤维素含量呈显著正相关（P < 0.05，r = 0.650）。从‘Q2’克隆的AgCESA5全长ORF为1803 bp，编码600个氨基酸（图S1）。AgCESA5序列已提交至NCBI GenBank，登录号为OP422647。为确定AgCESA5的亚细胞定位，通过农杆菌介导的瞬时表达系统将35S:AgCESA5-EGFP重组质粒导入本氏烟叶片表皮细胞。EGFP荧光信号在质膜中检测到，表明AgCESA5定位于质膜（图2B）。
【数据】HTJ中AgCESA5表达倍数：100 DAG为70 DAG的88倍；HTJ纤维素含量倍数：100 DAG为70 DAG的1.25倍；相关性：P<0.05，r=0.650；ORF长度：1803bp；编码氨基酸数：600
3.3 过表达AgCESA5的转基因芹菜纤维素含量分析
将35S:AgCESA5:GUS重组载体导入‘Q2’愈伤组织，通过组织培养获得再生植株（图3A）。将再生植株叶柄浸泡在X-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸）中鉴定阳性转基因株系，AgCESA5过表达转基因芹菜叶柄片段呈现蓝色染色（图3B）。随后以转基因和非转基因芹菜cDNA为模板进行PCR扩增，仅在转基因植株中检测到目标条带。筛选后选择3个转基因株系（OE-1、OE-2和OE-3）进行后续实验。转基因与对照芹菜株系之间未检测到明显形态差异。
采集转基因和非转基因芹菜叶柄样品测定纤维素和可溶性糖含量（图3C）。与对照植株（CK）相比，3个AgCESA5过表达株系的纤维素和可溶性糖含量均显著增加。非转基因芹菜纤维素含量为24.95 ± 0.97 g/100 g DW，而3个转基因株系分别为26.48 ± 0.27（OE-1）、31.48 ± 2.05（OE-2）和36.71 ± 4.13（OE-3）g/100 g DW。3个转基因株系（OE-1、OE-2和OE-3）的可溶性糖含量分别为非转基因芹菜的1.43倍、1.18倍和1.49倍。
【数据】CK纤维素含量：24.95±0.97 g/100g DW；OE-1纤维素含量：26.48±0.27 g/100g DW；OE-2纤维素含量：31.48±2.05 g/100g DW；OE-3纤维素含量：36.71±4.13 g/100g DW；可溶性糖倍数：OE-1为1.43倍，OE-2为1.18倍，OE-3为1.49倍
3.4 转基因芹菜株系细胞壁形态变化及AgCESA基因表达分析
制备转基因芹菜株系叶柄横切面并在光学显微镜下观察（图4A）。转基因芹菜维管束的大小和形状与非转基因芹菜相似（a、d、g和j）。然而，转基因株系细胞壁形态发生显著改变。非转基因芹菜的薄壁细胞壁光滑且呈圆形，而转基因芹菜薄壁细胞壁表现出折叠增加和异常肿胀（b、e、h和k）。与非转基因芹菜相比，转基因芹菜初生细胞壁呈现扭曲变形（c、f、i和l）。
通过RT-qPCR测定转基因和非转基因芹菜植株中AgCESA基因的相对表达水平（图4B）。3个转基因株系的AgCESA5表达水平均显著高于非转基因芹菜，倍数变化分别为168.46（OE-1）、113.04（OE-2）和602.44（OE-3）。AgCESA5的过表达促进了AgCESA1、AgCESA3和AgCESA8转录水平的上调，而AgCESA2、AgCESA4和AgCESA7的相对表达水平下降。
【数据】AgCESA5表达倍数：OE-1为168.46倍，OE-2为113.04倍，OE-3为602.44倍
3.5 AgMYB6/59对AgCESA5表达的激活分析及AgMYB6/59的表达
从‘Q2’gDNA中克隆AgCESA5启动子序列并提交至PlantCARE在线软件进行顺式元件分析。选择AgCESA5启动子中含5个MYB结合位点（CAGTTA、CAGTTG、CTGTTG、TGGTTG和TGGTTG）的DNA片段（−626～−26 bp）构建pAgCESA5-ABAi诱饵载体（图S2a）。将pAgCESA5-ABAi转化Y1H Gold酵母菌株。含有pAgCESA5-ABAi载体的酵母细胞在不含AbA的培养基上正常生长，而在含50 ng/mL AbA的培养基上生长受抑（图S2b）。因此，50 ng/mL AbA足以抑制诱饵载体在Y1H Gold中的自激活。
从Y1H文库筛选中获得两个候选转录因子序列，基因ID分别为Agr11480和Agr08646。NCBI BlastP同源性分析表明，Agr08646编码的蛋白与白桦（Betula platyphylla）BpMYB6（MK512591.1）具有89.66%的序列相似性；Agr11480编码的蛋白与胡萝卜（Daucus carota）DcMYB59（XP_017231479.1）具有86.96%的序列一致性。两个候选基因均被归类为R2R3-MYB转录因子，分别命名为AgMYB6和AgMYB59。后续Y1H验证显示，所有酵母转化体在不含AbA的SD/Leu⁻培养基上均正常生长。在含30～70 ng/mL AbA的SD/Leu⁻培养基上，共转化pAgCESA5-ABAi与AgMYB59-AD/AgMYB6-AD的酵母细胞维持正常生长，而携带空pGADT7的酵母在含AbA条件下无法存活（图5A）。AgMYB6/59与AgCESA5启动子的相互作用进一步通过LUC实验验证。将ProAgCESA5:LUC报告载体与效应载体共转化本氏烟叶片……
【数据】MYB结合位点数：5个（CAGTTA、CAGTTG、CTGTTG、TGGTTG、TGGTTG）；启动子片段位置：−626～−26bp；AbA抑制浓度：50ng/mL；Agr08646与BpMYB6相似性：89.66%；Agr11480与DcMYB59一致性：86.96%
讨论与解读
芹菜是重要的蔬菜作物，可食叶柄积累丰富营养物质。植物细胞壁在调节植物细胞生长、分化和免疫应答中发挥重要作用。纤维素作为最丰富的天然多糖，构成植物细胞壁的主要结构组分。作为膳食纤维的核心成分，适度纤维素积累可提升芹菜营养品质；然而过量纤维素沉积会降低叶柄嫩度和感官口感。因此，解析影响芹菜纤维素积累的调控因子，有助于通过基因工程调控芹菜品质。CESA基因家族成员在不同发育阶段的植物组织中表现出差异表达模式。例如，玉米中ZmCESA5的表达水平在胚乳发育前45天最高。在芹菜中，AgCESA2、AgCESA5和AgCESA7在100 DAG时表达水平最高，而AgCESA9在70 DAG时最高，提示AgCESA9可能参与生长早期阶段纤维素合成的调控。相关性分析显示AgCESA5表达水平与纤维素含量显著正相关，且过表达AgCESA5可显著提高转基因芹菜叶柄中纤维素和可溶性糖含量，证实AgCESA5是芹菜纤维素合成的正调控因子。薄壁细胞壁形态改变提示纤维素合成增加可能重塑了细胞壁结构。Y1H和LUC实验证实AgMYB59和AgMYB6可结合AgCESA5启动子并激活其转录，且两基因的表达模式与AgCESA5高度一致，表明二者可能作为AgCESA5的上游调控因子参与芹菜纤维素生物合成。
编译者解读
本研究从"品种筛选—基因鉴定—过表达验证—上游调控解析"形成了完整证据链，方法学上值得借鉴：通过多品种、双时间点的纤维素含量与基因表达相关性分析锁定关键候选基因，再以同源过表达进行功能验证，逻辑严密。尤其值得一提的是，研究同时关注了纤维素过量积累对薄壁细胞壁形态的影响，提示纤维素的"量"与细胞壁"结构重塑"之间的平衡是品质改良中不可忽视的问题。AgMYB6/59双转录因子对AgCESA5的协同调控机制尚待深入解析——二者是否存在竞争性或协同性结合、是否还调控其他CESA成员，原文未详述。从合成生物学应用角度看，该调控模块为未来通过精细调控纤维素合成强度来优化芹菜口感与膳食纤维含量提供了可操作的遗传靶点。
参考来源
Liu Pei-Zhuo. The cellulose synthase, AgCESA5, induces cellulose biosynthesis during cell walls formation in celery. Journal of Plant Physiology, 2026. DOI: 10.1016/j.jplph.2026.154862
DOI: 10.1016/j.jplph.2026.154862