来源：Functional expression of broccoli myrosinase in Bacillus subtilis: A GRAS microbial platform for enzyme production（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
萝卜硫素是一种具有重要生物活性的异硫氰酸酯化合物，其生成依赖于黑芥子酶对硫代葡萄糖苷的水解。然而，植物源黑芥子酶的有限可用性和不稳定性制约了其工业化应用。本研究首次在GRAS微生物——枯草芽孢杆菌中实现了西兰花黑芥子酶的异源功能表达，通过密码子优化和组成型启动子驱动，在粗蛋白提取物中检测到0.316–2.614 U mg⁻¹的比活力，为食品级萝卜硫素生产平台的建立提供了概念验证。
研究背景
萝卜硫素作为一种异硫氰酸酯，由硫代葡萄糖苷水解生成，因其公认的抗氧化、抗炎和化学预防特性，在功能食品和营养保健品领域备受关注。在芸薹科植物（如西兰花）中，萝卜硫素的形成依赖于黑芥子酶（β-硫代葡萄糖苷葡糖水解酶，EC 3.2.1.147）对硫代葡萄糖苷的水解。黑芥子酶-硫代葡萄糖苷系统构成植物重要的生化防御机制，从生物学和技术角度均已被广泛研究。
从应用角度看，可控的萝卜硫素生产需要稳定获取活性黑芥子酶。然而，直接使用植物来源的黑芥子酶存在多重限制：酶丰度低且波动大、加工过程中不稳定、严重依赖植物基因型、栽培条件和采后处理。此外，人体肠道微生物群相关的黑芥子酶活性较低，进一步限制了膳食摄入后内源性萝卜硫素的生成。这些因素共同制约了从植物来源实现萝卜硫素生产的可扩展性和可重复性。为克服上述瓶颈，微生物异源表达系统已被探索作为替代方案。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
枯草芽孢杆菌WEA（Bacillus subtilis WEA）用作异源表达实验的宿主菌株。采用表达载体pTTB2，在P43组成型启动子控制下进行组成型蛋白生产。构建了两种重组质粒：pTTB2-myr，编码西兰花黑芥子酶cDNA；pTTB2-myr-His，编码N端带His标签的酶版本。枯草芽孢杆菌菌株常规在37°C、200 rpm振荡条件下于Luria–Bertani（LB）培养基中培养，除非另有说明。需要时，按适当浓度添加抗生素以维持质粒选择压力。
【数据】宿主菌株：B. subtilis WEA；载体：pTTB2；启动子：P43（组成型）；培养基：LB；温度：37°C；转速：200 rpm
2.2 基因合成与质粒构建
西兰花（Brassica oleracea var. italica）黑芥子酶的编码序列经密码子优化以适配枯草芽孢杆菌表达，并由商业渠道合成。优化后的cDNA被克隆至pTTB2表达载体中，位于组成型P43启动子下游。用于亲和富集实验的His标签序列融合至黑芥子酶编码区的N端。在转化进入枯草芽孢杆菌WEA之前，通过限制性酶切分析和测序验证质粒构建的正确性。
【数据】基因来源：西兰花黑芥子酶cDNA；优化方式：密码子优化（适配B. subtilis）；克隆位点：P43启动子下游；标签：N端His标签（仅pTTB2-myr-His）；验证方法：限制性酶切+测序
2.3 枯草芽孢杆菌的感受态诱导与转化
本研究评估了两种基于感受态的转化策略。第一种方法采用基于极限培养基的SM1/SM2方案诱导天然感受态。简言之，细胞在营养限制条件下培养以促进感受态调节子的激活，随后加入DNA。与此同时，采用常规的HS/LS感受态诱导方案作为对照。将质粒DNA加入感受态细胞，转化子在含0.2%木糖的2xYT琼脂平板上筛选。转化效率以每微克DNA产生的菌落形成单位（CFU）计算。从两种方案获得的代表性克隆被选作进一步分析。
【数据】转化方案1：SM1/SM2极限培养基法；转化方案2：HS/LS常规法；筛选平板：2xYT琼脂+0.2%木糖；转化效率单位：CFU μg⁻¹ DNA
2.4 重组菌株的培养与蛋白提取
选取的重组枯草芽孢杆菌克隆在液体LB培养基中、37°C振荡培养至适当生长阶段。细胞通过离心收集，用缓冲液洗涤后进行破碎。粗蛋白提取物通过机械破碎细胞获得，随后离心去除细胞碎片。所得上清液直接用于酶活性测定和电泳分析。总蛋白浓度采用标准蛋白定量方法测定。
【数据】培养条件：LB液体培养基，37°C振荡；破碎方式：机械破碎；上清用途：酶活测定+电泳分析；蛋白定量：标准方法（原文未详述具体试剂盒）
2.5 黑芥子酶活性测定
黑芥子酶活性通过分光光度法测定黑芥子苷（sinigrin）水解速率来确定，测定条件参照前期研究。反应体系组成如下：800 µL 33 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0）和100 µL黑芥子苷溶液（1 mM）。混合物在37°C预孵育1分钟，随后加入100 µL粗蛋白提取物启动反应。反应混合物立即转移至石英比色皿（光程1 cm），在分光光度计上监测227 nm处吸光度下降，持续120秒。线性范围内的初始吸光度下降速率（ΔA/min）用于计算酶活性。1个黑芥子酶活性单位（U）定义为在测定条件下每分钟催化水解1 µmol黑芥子苷所需的酶量。
酶活性按以下公式计算：
U (mL⁻¹) = (ΔA/min) × (1 / ε·l) × (V_A / V_E) × 10³
其中，ε为黑芥子苷在227 nm处的摩尔消光系数（6784 M⁻¹ cm⁻¹），l为光程（1 cm），V_A为总测定体积（1.0 mL），V_E为酶提取物体积（0.1 mL）。比活力以每毫克总蛋白的酶单位数（U mg⁻¹）表示。所有测定均进行两次独立实验并设技术重复，结果以均值±标准差表示。
【数据】底物：黑芥子苷（sinigrin）；底物浓度：1 mM；缓冲液：33 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0）；反应体积：1.0 mL（800 µL缓冲液+100 µL底物+100 µL酶液）；预孵育：37°C，1 min；检测波长：227 nm；监测时间：120 s；ε=6784 M⁻¹ cm⁻¹；光程：1 cm；酶单位定义：每分钟水解1 µmol黑芥子苷
2.6 SDS–PAGE分析
蛋白样品在变性条件下进行SDS–PAGE分析。粗提取物中等量总蛋白上样至聚丙烯酰胺凝胶，按分子量大小分离。凝胶采用标准蛋白染色方法显色以观察蛋白条带。使用蛋白分子量标记估算重组黑芥子酶的表观分子量。
【数据】电泳条件：变性SDS–PAGE；上样量：等量总蛋白；染色：标准蛋白染色法；分子量标记：商用蛋白marker
2.7 His标签黑芥子酶的亲和富集
在进行亲和吸附之前，粗提取物按照补充材料所述进行硫酸铵沉淀处理。表达His标签黑芥子酶的枯草芽孢杆菌克隆的粗提取物，按照制造商说明书（Novagen®）使用Ni-Sepharose树脂进行亲和吸附。结合后，用洗涤缓冲液去除非特异性结合蛋白，结合蛋白用含咪唑的缓冲液洗脱。洗脱组分通过SDS–PAGE分析并测定黑芥子酶活性，以确认富集后催化功能的保留。
【数据】预处理：硫酸铵沉淀（详见补充材料）；亲和树脂：Ni-Sepharose（Novagen®）；洗脱：含咪唑缓冲液；验证：SDS–PAGE+酶活测定
2.8 统计分析
所有实验均使用独立的生物学重复。数据以平均值±标准差表示。适用时，结果采用描述性统计方法分析。
【数据】重复方式：独立生物学重复；数据表示：均值±标准差；统计方法：描述性统计
详细的培养基组成、完整转化方案及额外方法学细节见补充材料。
研究结果
3.1 枯草芽孢杆菌WEA基于感受态的转化策略建立
高效的DNA摄取是在枯草芽孢杆菌中可重复建立异源表达系统的关键要求。本研究评估了两种基于感受态的转化策略：常规HS/LS方法和基于极限培养基的SM1/SM2方案。SM1/SM2方案 consistently 产生更高的转化效率，转化子数量约为HS/LS方法的10倍（约10⁶ CFU μg⁻¹ DNA对比约10⁵ CFU μg⁻¹ DNA）。这一观察与先前研究一致，表明营养限制和生长阶段控制促进枯草芽孢杆菌感受态调节子的激活。基于这些结果，使用两种转化方法获得的代表性克隆被选作进一步表征，包括酶活性测定和蛋白分析（表1）。尽管转化效率差异不直接影响酶活性，但SM1/SM2方案更高的可重复性和稳健性支持其用于未来的菌株开发。
【数据】SM1/SM2方案转化效率：~10⁶ CFU μg⁻¹ DNA；HS/LS方案转化效率：~10⁵ CFU μg⁻¹ DNA；效率差异：约一个数量级
3.2 西兰花黑芥子酶在枯草芽孢杆菌中的功能表达
携带pTTB2-myr或pTTB2-myr-His构建体的重组枯草芽孢杆菌克隆在粗蛋白提取物中表现出可检测的黑芥子酶活性，而未转化对照菌株未观察到活性（表1）。这一结果确认观察到的活性来源于异源表达的西兰花黑芥子酶，而非枯草芽孢杆菌内源酶。重组克隆粗提取物的比活力范围为0.316至2.614 U mg⁻¹（表1）。使用SM1/SM2感受态诱导方案获得的克隆倾向于比HS/LS方法获得的克隆表现出更高的活性水平，尽管两种情况均观察到变异性。例如，来源于SM1/SM2方案的克隆2a和2b显示出最高的平均比活力（分别为2.614和1.770 U mg⁻¹），而多个HS/LS来源的克隆显示出较低的活性值和更大的离散度。这种行为最可能归因于转化效率、质粒摄取均匀性和感受态细胞生理状态的差异，而非酶催化本身的固有差异。类似的克隆间变异性在其他基于枯草芽孢杆菌的异源表达系统中也有报道，反映了植物来源酶对胞内表达条件的敏感性，包括折叠限制、蛋白酶敏感性和氧化还原平衡。
需要强调的是，所报告的比活力对应于粗蛋白提取物。因此，这些值反映了表达水平、折叠效率、胞内稳定性和细胞破碎过程中的回收率的综合效应，而非纯化黑芥子酶的固有催化活性。因此，应避免与已报道的纯化植物黑芥子酶或高度优化重组系统的动力学参数进行直接比较。尽管如此，在粗提取物水平考量时，本研究中观察到的活性值处于此前报道的西兰花黑芥子酶在大肠杆菌和酿酒酵母中异源表达（在广泛优化之前）的范围内。这支持了枯草芽孢杆菌作为功能黑芥子酶生产替代宿主在概念验证阶段的可行性。
【数据】比活力范围：0.316–2.614 U mg⁻¹；克隆2a（SM1/SM2来源）平均比活力：2.614 U mg⁻¹；克隆2b（SM1/SM2来源）平均比活力：1.770 U mg⁻¹；对照菌株活性：未检出
3.3 重组黑芥子酶的电泳分析与亲和富集
对重组枯草芽孢杆菌克隆（表1）粗提取物的SDS–PAGE分析显示，在约64.5 kDa处出现一条明显蛋白条带，与西兰花黑芥子酶单体的预期分子量一致（图1）。在未转化对照菌株的提取物中也观察到相似电泳迁移率的条带，考虑到枯草芽孢杆菌蛋白质组的复杂性以及该分子量范围内内源蛋白的存在，这并不意外。重要的是，使用Ni-Sepharose的亲和吸附选择性富集了His标签黑芥子酶，获得的组分保留了酶活性。在整个纯化流程中，对照菌株未检测到黑芥子酶活性，这证实观察到的催化活性与重组酶相关，而非与共迁移的内源蛋白相关。这些结果证明重组黑芥子酶的功能完整性及其与标准亲和下游加工策略的兼容性。尽管纯化仍是部分性的，回收率未进行定量优化，但这一富集水平足以支持平台可行性并为未来下游加工的改进提供指导。
【数据】目标蛋白分子量：~64.5 kDa；富集方式：Ni-Sepharose亲和吸附；富集后活性：保留；对照菌株纯化流程中活性：未检出
3.4 技术考量与局限性
本研究报告的比活力与纯化植物黑芥子酶或高度优化的异源系统相比仍属温和水平。可能的影响因素包括：枯草芽孢杆菌缺乏糖基化修饰，这可能影响植物来源酶的折叠和稳定性；以及细胞破碎和硫酸铵沉淀过程中的潜在损失。现阶段的首要目标并非最大酶产量或全面的生化表征，而是建立一个能够生产具有功能活性黑芥子酶的GRAS兼容微生物平台。
从工业角度看，使用枯草芽孢杆菌作为生产宿主具有多项优势，特别是在食品和营养保健品应用中。作为GRAS微生物，枯草芽孢杆菌因其安全性、无内毒素以及在工业发酵中的广泛使用而被普遍接受用于酶生产。尽管本研究中观察到的活性水平温和且克隆间存在变异性，但黑芥子酶的成功功能表达为未来工艺开发奠定了基础。潜在改进方向包括：基于分泌的表达策略以简化下游处理、使用蛋白酶缺陷型菌株以增强酶稳定性、以及优化培养条件以提高体积产率。
在此背景下，本研究所描述的平台可能推动可扩展系统的开发，用于受控的硫代葡萄糖苷水解和生产生物活性异硫氰酸酯（如萝卜硫素），这些化合物在功能食品和营养保健品配方中日益受到关注。未来工作可能聚焦于分泌型表达策略、蛋白酶缺陷菌株、分子伴侣共表达和工艺优化，以改善酶回收率、稳定性和产率，从而支持可扩展的食品级生物工艺的开发，用于受控的硫代葡萄糖苷转化和萝卜硫素相关应用。
【数据】比活力水平：温和（与纯化植物酶或优化系统相比）；影响因素：缺乏糖基化、破碎损失、硫酸铵沉淀损失；宿主优势：GRAS状态、无内毒素、工业发酵经验
讨论与解读
本研究首次建立了西兰花黑芥子酶在枯草芽孢杆菌中的功能性异源表达。利用组成型表达系统和基于感受态的转化策略，研究者在粗提取物中证实了可重复的酶活性，并确认了与预期分子量一致的蛋白生产。尽管未进行酶纯化和详细的生化表征，但催化活性的检测及其通过亲和吸附的富集提供了概念验证证据：枯草芽孢杆菌可作为植物黑芥子酶生产的可行宿主。观察到的活性水平反映了表达效率、折叠和下游回收的综合效应，应在平台建立的语境中解读，而非固有酶性能。
从技术角度看，枯草芽孢杆菌提供了重要优势：法规接受度高、无内毒素、与大规模酶制造兼容。虽然初始活性水平与优化系统相比仍属温和，但本平台为未来通过分泌策略、菌株工程和工艺开发实现优化提供了基础。
编译者解读：本研究选择枯草芽孢杆菌而非大肠杆菌作为表达宿主，策略性地规避了内毒素污染问题——这对食品级酶生产是决定性优势。粗提取物中2.6 U mg⁻¹的比活力虽不及纯化酶，但已足以支撑概念验证。值得关注的是，作者明确承认糖基化缺失可能影响植物酶折叠，这提示未来的关键突破点或在分泌表达与共表达分子伴侣的协同策略。此外，SM1/SM2转化方案相比HS/LS提升一个数量级的效率，为后续高通量菌株筛选提供了实用工具。本工作的价值在于打通了"植物酶→GRAS宿主"的路径，而非追求极致产量。
参考来源
Pozo Y. Functional expression of broccoli myrosinase in Bacillus subtilis: A GRAS microbial platform for enzyme production. Enzyme and Microbial Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110889
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110889