来源：Regulatory roles of Smt3, an ortholog of small ubiquitin-like modifier, in fungal development and the production of amylases and organic acids in Aspergillus niger（Food Microbiology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
黑曲霉兼具食品发酵与食品腐败的双重身份，其胞外酶与有机酸代谢调控机制备受关注。本研究在普洱茶源黑曲霉RAF106中鉴定出唯一的SUMO同源蛋白Smt3，通过基因敲除、表型分析及转录检测等手段，揭示了Smt3在真菌生长、产孢、线粒体功能及淀粉酶和有机酸合成中的多重调控角色。研究发现Smt3通过与AmyR及多种淀粉酶蛋白的直接互作促进淀粉酶合成与分泌，为工业菌株改良提供了新靶点。
研究背景
翻译后修饰（PTM）是真核生物调控多样细胞过程的基础机制。SUMO化修饰通过将小泛素样修饰蛋白（SUMO）共价连接到靶蛋白上，调控靶蛋白的稳定性、亚细胞定位及蛋白间相互作用，从而影响真核生物的发育、环境适应、免疫应答及致病性等多种生理过程。在多种丝状真菌中，SUMO的功能研究已揭示其关键而多样的角色：构巢曲霉中敲除SUMO编码基因smt3会损害产孢和次生代谢；黄曲霉中sumo正调控产孢及主要黄曲霉毒素AFB1和AFB2的合成；球孢白僵菌中smt3缺失则导致产孢缺陷、细胞壁完整性受损及菌丝耐热性下降。然而，SUMO在CAZyme（碳水化合物活性酶）和有机酸产生中的功能仍不清楚，在具有食品发酵与腐败双重角色的黑曲霉中也未见功能报道。本研究以普洱茶分离的黑曲霉RAF106为对象，系统解析了其唯一的SUMO同源蛋白Smt3的生物学功能。
研究方法
2.1 微生物菌株与培养条件
野生型（WT）黑曲霉RAF106（CGMCC No. 9608）及其突变体在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA；含20%马铃薯浸出液、2%葡萄糖、2%琼脂）、沙氏葡萄糖琼脂（SDAY；含4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母提取物、2%琼脂）、察氏琼脂（CZA；含3%蔗糖、0.3% NaNO₃、0.1% K₂HPO₄、0.05% KCl、0.05% MgSO₄、0.001% FeSO₄、2%琼脂）及麦麸稻草琼脂（WSA；含5.5%稻草粉、3%蛋白胨、0.2% KH₂PO₄、0.16% (NH₄)₂SO₄、0.02% MgSO₄、0.001% CaCl₂、0.0002% ZnCl₂、0.02%尿素、2%琼脂，pH 5.0）上于30°C培养，用于真菌生长和产孢实验。环境适应相关表型及CAZyme产生能力分别在PDA和麦麸稻草液体培养基（WSB；即WSA不含琼脂配方）上评估。大肠杆菌DH5α（Invitrogen，上海）用于质粒扩增，在LB培养基中于37°C培养。根癌农杆菌AGL-1作为T-DNA供体用于真菌转化，在YEB培养基中于28°C培养。
【数据】培养基：PDA/SDAY/CZA/WSA/WSB/LB/YEB；温度：30°C（真菌）/37°C（大肠杆菌）/28°C（农杆菌）；pH：WSA为5.0
2.2 黑曲霉smt3基因的克隆与分析
以NCBI登录号RIBO00000000下的WT基因组为模板，使用配对引物（表S1）扩增唯一的SUMO编码基因smt3（基因座标签：gene02859），并由北京六合华大基因科技有限公司测序。推导蛋白序列通过在线BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析。使用MEGA 7.0软件中的邻接法构建与其他真菌SUMO同源蛋白的系统发育树。分子量（MW）和理论等电点（pI）通过在线工具（https://web.expasy.org/protparam/）预测。
【数据】基因：smt3（gene02859）；NCBI登录号：RIBO00000000；测序公司：北京六合华大基因；分析软件：MEGA 7.0
2.3 亚细胞定位
以增强型绿色荧光蛋白（eGFP）为报告基因，通过融合构建确定靶蛋白的亚细胞定位。简言之，从pLV-UBC-mCherry-EGFP-CCDC50（武汉淼灵质粒有限公司）扩增含有bleo（赋予博来霉素抗性）启动子和开放阅读框的表达盒，使用Uniclone One Step无缝克隆试剂盒克隆至p0380-hygB（赋予潮霉素B抗性）中，构建p0380-bleo。分别以pAN52-eGFP质粒为模板扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子gpdA（PgpdA）和eGFP基因。靶基因x（x：smt3、amyR、amyA、amyC、amyD、amyE、amyF、amyG、amyH或amyM）的编码序列及trpC终止子（TtrpC）分别从WT cDNA和p0380-hygB质粒扩增。四个片段通过Uniclone One Step无缝克隆试剂盒连接至p0380-bleo，形成p0380-bleo-PgpdA-x-eGFP-TtrpC。各融合质粒通过农杆菌介导转化导入WT或相应突变体。表达X::eGFP融合蛋白的阳性转化子以10⁸孢子/mL浓度接种至PDB或WSB中，30°C振荡培养24小时后收集菌丝，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）冲洗，以核染料4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI，Sigma，美国）染色，在激光共聚焦显微镜（Leica，上海）或荧光显微镜（Nikon，日本）下观察。
【数据】孢子浓度：10⁸孢子/mL；培养时间：24h；温度：30°C；PBS：pH 7.0；染料：DAPI
2.4 Δsmt3与Δsmt3::smt3的构建
smt3缺失突变体（Δsmt3）通过同源重组方法构建。简言之，从WT基因组扩增smt3的5′和3′片段，分别经BamHI/HindIII和XbaI/BglII酶切位点依次连接至p0380-hygB，形成敲除质粒p0380-5′smt3-hygB-3′smt3。遗传互补方面，从WT基因组扩增含侧翼序列的smt3全长序列，克隆至经HindIII/SacI酶切的p0380-bleo中，获得互补质粒p0380-bleo-smt3。敲除质粒和互补质粒分别通过农杆菌介导转化导入WT和Δsmt3。推定转化子在含头孢噻肟（300 μg/mL）和潮霉素B（50 μg/mL）或博来霉素（50 μg/mL）的培养基上筛选，并通过PCR、基因测序及定量实时PCR（qRT-PCR）鉴定。Δsmt3在所有后续实验中均以WT和Δsmt3::smt3作为对照进行评价。
【数据】头孢噻肟：300 μg/mL；潮霉素B：50 μg/mL；博来霉素：50 μg/mL；限制性内切酶：BamHI/HindIII、XbaI/BglII、HindIII/SacI
2.5 真菌生长与产孢分析
真菌生长通过将1 μL孢子悬液（1 × 10⁶孢子/mL）点接于SDAY、PDA、WSA、CZA或改良CZA平板（直径9 cm）上评估。CZA改良包括以等浓度葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、果糖、半乳糖、甘油或乙酸钠替代蔗糖，或以NH₄Cl或NaNO₂替代NaNO₃，或省略蔗糖或NaNO₃。30°C培养3天后，在两个垂直方向测量菌落直径以评估径向生长。所有实验重复三次。产孢能力评估中，取100 μL孢子悬液（1 × 10⁶孢子/mL）均匀涂布于SDAY、CZA、PDA和WSA平板（直径9 cm），30°C培养。从第2天起，每天用打孔器从每板随机切取3个5 mm直径菌块，分别置于1 mL 0.02% Tween 80溶液中涡旋10 min以释放孢子。悬液经四层擦镜纸过滤去除菌丝碎片。孢子浓度用血球计数板测定并换算为每cm²菌落的孢子数。所有实验重复三次。此外，用刀片切片3日龄培养物，按先前描述方法在光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）下观察分生孢子梗形态。分生孢子细胞壁通过透射电子显微镜（TEM）评估。所有实验重复三次。
【数据】孢子悬液：1 × 10⁶孢子/mL（点接1 μL/涂布100 μL）；培养温度：30°C；培养时间：3天（生长）/2天起逐日（产孢）；Tween 80：0.02%；涡旋：10 min；菌块直径：5 mm
2.6 菌丝与菌球形态观察
取1 mL孢子悬液（10⁸孢子/mL）接种至100 mL PDB（不含琼脂的PDA）中，于30°C、180 rpm振荡培养48 h。收集菌丝进行显微镜观察。同时用数码相机记录菌球形态。
【数据】孢子浓度：10⁸孢子/mL；培养基体积：100 mL PDB；温度：30°C；转速：180 rpm；时间：48h
2.7 线粒体膜电位（MMP）、活性氧（ROS）与自噬检测
在PDB中培养24 h的真菌菌丝经收集后，以10 μM JC-1（宇业生物，中国）于37°C避光染色20 min评估MMP，或以10 μM 2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H₂-DCF-DA；碧云天，上海）于37°C避光染色30 min检测ROS产生。孵育后所有样品用PBS（10 mM，pH 7.5）洗涤三次。荧光通过激光共聚焦显微镜观察。所有实验重复三次。自噬以单丹磺酰尸胺（MDC，碧云天，上海）为探针检测。菌丝于37°C避光染色10 min，在荧光显微镜紫外激发下观察。所有检测的荧光强度用ImageJ软件对每张图像进行定量。所有实验重复三次。
【数据】JC-1浓度：10 μM，37°C，20 min；H₂-DCF-DA浓度：10 μM，37°C，30 min；PBS：10 mM，pH 7.5；MDC染色：37°C，10 min
2.8 淀粉酶、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性测定
淀粉酶活性按先前描述方法测定。简言之，将1 mL孢子悬液接种至WSB培养基中培养，定期取样测定胞外与胞内淀粉酶活力。SOD和CAT活性分别采用氮蓝四唑光还原法和紫外吸收法测定，以每毫克蛋白的酶活力单位表示。所有实验重复三次，数据以平均值±标准差表示，采用Student's t检验进行差异显著性分析（P < 0.05为显著差异）。
【数据】统计分析：Student's t检验，P < 0.05为显著差异
2.9 有机酸含量测定与胁迫耐受性分析
将WT、Δsmt3和Δsmt3::smt3菌株分别接种于WSB培养基中，30°C静置培养3天后，取培养液上清测定pH值、总酸含量及草酸和苹果酸含量。有机酸含量采用高效液相色谱法测定。胁迫耐受性实验将孢子悬液点接于含不同浓度NaCl、山梨醇、刚果红或H₂O₂的PDA平板上，30°C培养3天后测量菌落直径。果实腐败能力实验以苹果为底物，将孢子悬液接种于苹果表面，观察病斑扩展情况。所有实验重复三次。
【数据】培养时间：3天；温度：30°C
研究结果
3.1 黑曲霉Smt3的生物信息学特征
以酿酒酵母、构巢曲霉和黄曲霉的SUMO序列为查询序列，在黑曲霉基因组中鉴定到唯一的smt3基因。smt3的开放阅读框由267个碱基组成，无内含子，推导蛋白含88个氨基酸，分子量约9.88 kDa，等电点4.76。保守结构域分析显示Smt3具有保守的双甘氨酸残基但缺少C端氨基酸延伸，并含有与Ulp1、Ubc9、Ysmb1、PCNA、FadD32、Xopd互作的高度保守位点及一个保守的关键赖氨酸K6（图S1A）。系统发育分析显示Smt3与曲霉属（Aspergillus cristatus）同源蛋白相似性最高（96.37%），与巴西青霉（Penicillium brasilianum）相似性最低（87.85%）（图S1B）。为研究Smt3的亚细胞定位，构建了在WT中表达Smt3::eGFP融合蛋白（由gpdA启动子驱动）的转化子。荧光显微镜观察显示Smt3在菌丝的细胞质和细胞核中均有分布（图S1C）。
【数据】smt3 ORF：267 bp，无内含子；蛋白：88个氨基酸；分子量：约9.88 kDa；pI：4.76；相似性：96.37%（A. cristatus）/87.85%（P. brasilianum）
3.2 smt3缺失对黑曲霉径向生长和菌丝形态的影响
smt3的缺失突变体和互补突变体分别通过同源置换和异位整合构建，并经PCR、基因测序和qRT-PCR验证（图S2和图S3）。在Δsmt3中，smt3全长序列被删除（图S3）。Δsmt3中smt3的转录水平几乎检测不到，而在Δsmt3:smt3中恢复至WT水平（图S2C）。这些结果表明smt3对黑曲霉的生存非必需。在30°C培养3天后，Δsmt3在PDA、WSA和SDAY培养基上形成的菌落显著小于WT和Δsmt3:smt3（图1A）。定量分析显示，Δsmt3的菌落面积在PDA、WSA和SDAY上分别减少了24.74%、30.87%和34.95%（图1A）。此外，在以葡萄糖、半乳糖、海藻糖、乙酸钠、NaNO₂、NH₄Cl为碳/氮源或缺失氮源的改良CZA培养基上，smt3缺失导致菌落尺寸降低11.70%-56.93%（图1A）。相比之下，Δsmt3在CZA及以麦芽糖或甘油为碳源的改良CZA上的菌落尺寸与WT和Δsmt3:smt3相当（图1A）。另外，Δsmt3形成更小的菌球（图1B和S4A），其菌丝膨胀，比WT和Δsmt3:smt3宽28.87%（图1B和图S4B）。然而，在PDB振荡培养条件下，WT、缺失突变体和互补菌株之间的菌丝分枝频率无明显差异（数据未显示）。
【数据】菌落面积减少：PDA 24.74%、WSA 30.87%、SDAY 34.95%；改良CZA菌落减少：11.70%-56.93%；菌丝宽度增加：28.87%
3.3 smt3缺失对线粒体膜电位、ROS稳态和自噬的影响
JC-1染色显示，与WT和Δsmt3:smt3相比，Δsmt3呈现更强的绿色荧光和更弱的红色荧光（图2A），表明线粒体膜电位（MMP）严重丧失。与MMP受损一致，DCFH-DA染色显示Δsmt3细胞呈现更强的绿色荧光（图2B），表明胞内ROS积累升高。相应地，编码交替氧化酶1的aoxA基因在Δsmt3中的转录水平下降了73.35%（图2C）。两个核心电子传递链（ETC）亚基基因nuoA和qcr2的转录分别轻微下调24.60%和17.47%（图2C）。有趣的是，SOD和CAT的活性分别增加了112.31%和16.84%（图2D）。此外，MDC染色显示Δsmt3中有更多带有绿色荧光的自噬体（图2E）。与此表型一致，atg1的转录丰度增加了66.60%（图2C）。综上，smt3缺失诱发了过度自噬及线粒体功能障碍（包括ROS过量产生、ETC抑制和MMP受损）。
【数据】aoxA转录下降：73.35%；nuoA下调：24.60%；qcr2下调：17.47%；SOD活性增加：112.31%；CAT活性增加：16.84%；atg1转录增加：66.60%
3.4 smt3在黑曲霉产孢中的作用
首先，smt3缺失导致严重的产孢缺陷。与WT在5天培养期间的数值相比，Δsmt3的孢子平均产量在PDA平板上减少56.88%-79.06%，在WSA平板上减少61.74%-66.02%，在SDAY平板上减少41.80%-61.49%，在CZA平板上减少43.73%-56.27%（图3A-D）。伴随孢子产量减少，Δsmt3的分生孢子梗变得较小且不够饱满，尽管其数量与WT相当（图3E和F）。透射电子显微镜（TEM）观察显示，WT分生孢子壁最外层清晰致密，而Δsmt3中变得较为松散（图3G）。此外，Δsmt3中fluG、flbA、flbC、flbE、veA、brlA和wetA的转录分别被抑制了53.01%、31.56%、62.20%、31.77%、16.52%、43.06%和44.15%，而sfgA和flbB的转录分别上调了40.89%和120.47%（图3H）。smt3缺失引起的所有表型变化均在Δsmt3:smt3中得到良好恢复。这些数据表明Smt3对黑曲霉的产孢至关重要。
【数据】孢子产量减少：PDA 56.88%-79.06%、WSA 61.74%-66.02%、SDAY 41.80%-61.49%、CZA 43.73%-56.27%；转录抑制：fluG 53.01%、flbA 31.56%、flbC 62.20%、flbE 31.77%、veA 16.52%、brlA 43.06%、wetA 44.15%；转录上调：sfgA 40.89%、flbB 120.47%
3.5 smt3对黑曲霉淀粉酶产生的重要性
smt3缺失损害了总淀粉酶的产生。与WT胞外淀粉酶32.07 U/mL和胞内淀粉酶3.82 U/mL的数值相比，Δsmt3的胞外淀粉酶活性降低了64.26%，但胞内活性增加了17.95%（图4A和B）。与此一致，淀粉分解调控因子amyR的转录在Δsmt3中下调了61.17%（图4C）。在淀粉酶基因中，六个基因（amyA、amyD、amyE、amyF、amyG和amyM）的表达下调了21.10%-66.07%，而amyC和amyH的表达分别上调了66.07%和199.90%（图4C）。所有表型变化均在Δsmt3:smt3中得到良好恢复。进一步通过酵母双杂交实验检测Smt3与AmyR及八种淀粉酶蛋白之间的相互作用。对照实验证实诱饵构建体pGBKT7-amyR和pGBKT7-smt3无毒性且不自激活报告基因（图S5）。如图4所示，共转化pGBKT7-amyR与pGADT7-smt3、pGBKT7-smt3与pGADT7-amyA、pGADT7-amyD、pGADT7-amyE或pGADT7-amyG的酵母细胞在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上生长良好（图4D），而共转化pGBKT7-smt3与pGADT7-amyC、pGADT7-amyF、pGADT7-amyH或pGADT7-amyM的细胞则无法生长（图4D）。此外，利用保守的Ψ-K-X-E/D基序和GPS-SUMO软件预测了AmyR、AmyA、AmyD、AmyE和AmyG序列中潜在的SUMO结合位点。该分析预测AmyR中有三个推定赖氨酸残基（K213、K480和K87），AmyA中有两个（K308和K340），AmyD中有三个（K300、K409和K212），AmyE中有两个（K405和K431），AmyG中有两个（K607和K122）（表1）。将这些赖氨酸残基单独或同时替换为精氨酸后，通过酵母双杂交实验检测其对Smt3相互作用的影响。结果显示，Smt3无法与AmyRK213R、AmyAK308/340R、AmyDK300R、AmyDK409R、AmyEK405/431R或AmyGK607R互作（图5）。这些发现表明，在酵母细胞内Smt3与AmyR、AmyA、AmyD、AmyE和AmyG存在互作，但与AmyC、AmyF、AmyH或AmyM无互作；AmyR中的K213、AmyD中的K300和K409、AmyG中的K607、AmyA中的赖氨酸对K308和K340以及AmyE中的K405和K431为Smt3互作所必需。此外，AmyR::eGFP在WT和Δsmt3中均分布于细胞核和细胞质，表明Smt3不影响AmyR的亚细胞定位（图4E）。进一步地，smt3缺失降低了AmyA::eGFP、AmyC::eGFP、AmyD::eGFP、AmyE::eGFP、AmyG::eGFP的荧光信号。
【数据】WT胞外淀粉酶：32.07 U/mL；WT胞内淀粉酶：3.82 U/mL；Δsmt3胞外淀粉酶活性降低：64.26%；胞内活性增加：17.95%；amyR转录下调：61.17%；amyA/amyD/amyE/amyF/amyG/amyM下调：21.10%-66.07%；amyC上调：66.07%；amyH上调：199.90%
【数据】SUMO化位点预测：AmyR（K213、K480、K87）；AmyA（K308、K340）；AmyD（K300、K409、K212）；AmyE（K405、K431）；AmyG（K607、K122）
3.6 smt3缺失对有机酸产生、化学胁迫耐受性及果实腐败能力的影响
在WSB培养基中培养3天后，Δsmt3培养液的pH值高于WT和Δsmt3:smt3（图6A），总酸含量降低（图6B），草酸和苹果酸含量均显著下降（图6C和D）。在化学胁迫耐受性方面，Δsmt3对山梨醇的敏感性增加，但对NaCl、刚果红和H₂O₂的耐受性与WT相比无明显变化（图6E）。果实腐败能力实验显示，Δsmt3在苹果上的致腐能力与WT相当，未表现出明显差异。
【数据】培养时间：3天（WSB）；pH值：Δsmt3高于WT；总酸：Δsmt3降低；草酸和苹果酸：Δsmt3均降低；胁迫类型：山梨醇敏感增加，NaCl/刚果红/H₂O₂无变化
讨论与解读
Smt3作为黑曲霉中唯一的SUMO同源蛋白，定位于细胞核与细胞质，这与罗伯茨绿僵菌中的发现一致。smt3缺失导致黑曲霉营养生长轻微但显著的缺陷，与构巢曲霉、西瓜枯萎病菌和稻瘟病菌中的观察相符，但不同于黄曲霉和罗伯茨绿僵菌中正常条件下无明显生长受损的报道。生长缺陷与多种碳/氮源利用受限、线粒体功能障碍及过度自噬相关。smt3缺失严重损害产孢能力，表现为孢子产量降低、分生孢子梗发育不良及产孢相关基因转录下调。值得注意的是，smt3缺失降低了淀粉酶和有机酸（尤其是草酸和苹果酸）的产量。机制上，Smt3通过激活转录因子amyR、内质网伴侣蛋白（kar2和lhs1）及分泌相关flbE的表达促进淀粉酶合成与分泌，同时通过调控核心代谢基因表达和抑制异常自噬来调节草酸与苹果酸的产生。此外，Δsmt3对山梨醇的敏感性增加，但果实腐败能力和对NaCl、刚果红、H₂O₂的胁迫耐受性不变。
编译者解读：本研究首次系统描绘了SUMO化修饰在黑曲霉CAZyme与有机酸代谢中的调控网络，具有明确的工业应用指向。方法上采用多表型联检与酵母双杂交筛选关键SUMO化位点，策略扎实且可移植到其他工业丝状真菌。值得关注的是Smt3对胞外淀粉酶的正向调控与对胞内酶活的负向影响并存——提示SUMO化修饰可能参与分泌通路的开关调控，而非简单激活酶基因表达。局限性在于研究主要停留在表型与转录关联层面，Smt3对靶蛋白SUMO化修饰的动态调控（如去SUMO化酶参与）及工业发酵条件下的实际应用效果尚待进一步验证。该工作为黑曲霉产酶菌株的定向改造提供了新靶标。
参考来源
Zhu Y. Regulatory roles of Smt3, an ortholog of small ubiquitin-like modifier, in fungal development and the production of amylases and organic acids in Aspergillus niger. Food Microbiology, 2027. DOI: 10.1016/j.fm.2026.105237
DOI: 10.1016/j.fm.2026.105237