来源：The nirB and nirD genes are essential for both assimilatory and dissimilatory reduction of nitrite in Pseudomonas putida Y-9 under aerobic conditions（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
亚硝酸盐还原是氮循环中的关键步骤，但负责该过程的nirB与nirD基因在好氧细菌中究竟如何分工协作，此前并不清楚。本研究以分离自水稻土的恶臭假单胞菌Y-9为对象，通过基因敲除、回补实验、15N同位素示踪和基因表达分析，系统揭示了nirB和nirD在好氧条件下对同化型硝酸盐还原（ANRA）和异化型硝酸盐还原（DNRA）均不可或缺。研究发现，单独敲除任一基因都会导致亚硝酸盐严重积累和生长抑制，且另一基因的强烈上调也无法补偿功能缺失，证明两基因功能不可冗余。
研究背景
氮是陆地和淡水生态系统中的关键限制性营养元素，其去向主要由微生物转化过程决定。反硝化和厌氧氨氧化通过将活性氮转化为气态形式（N2O和N2）造成氮损失；而异化型硝酸盐还原为铵（DNRA）和同化型硝酸盐还原为铵（ANRA）则将硝酸盐还原为铵，前者释放NH4+以维持氧化还原平衡，后者将NH4+直接掺入生物量。尽管两条途径生理角色不同，但最终都产生NH4+这一稳定且生物可利用的氮形式。在酶学层面，ANRA和DNRA均涉及硝酸盐还原酶（Nar或Nap）将NO3–依次还原为NO2–，再将NO2–转化为NH4+。在ANRA中，NO2–到NH4+的还原仅由细胞质NADH依赖性亚硝酸盐还原酶NirBD介导；而在DNRA中，该步骤可由NirBD或周质空间中的其他酶催化。然而，nirB和nirD是独立发挥作用还是协同作用，以及它们是否影响其他氮转化过程，此前尚不清楚。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用菌株为恶臭假单胞菌Y-9（Pseudomonas putida Y-9），分离自中国贵州省长期淹水的稻田土壤。基因组测序数据已提交至NCBI（BioProject登录号：PRJNA1125840），nirBD基因序列登录号为MK561362.1。
LB培养基用于细菌富集培养，配方为（每升）：胰蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g，NaCl 10.00 g，pH调至7.0–7.2。
硝化培养基（NM）用于评估菌株Y-9的NH4+转化能力，配方为（每升）：K2HPO4·3H2O 7.00 g，KH2PO4 3.00 g，MgSO4·7H2O 0.10 g，(NH4)2SO4 0.25 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，CH3COONa 2.60 g，pH调至7.0–7.2。
反硝化培养基（DM）用于评估菌株Y-9的NO3–或NO2–转化能力，基础配方为（每升）：K2HPO4·3H2O 7.00 g，KH2PO4 3.00 g，MgSO4·7H2O 0.10 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，CH3COONa 2.60 g。NO3–还原实验（DM-1）中添加0.30 g NaNO3作为唯一氮源；NO2–还原实验（DM-2）中以0.25 g NaNO2替代NaNO3。两种培养基均用HCl或NaOH调pH至7.0–7.2。固体培养基添加2%（w/v）琼脂。所有培养基使用前在121°C、0.11 MPa条件下高压灭菌30 min。
【数据】菌株：恶臭假单胞菌Y-9；培养基：LB、NM、DM-1、DM-2；温度：121°C（灭菌）；压力：0.11 MPa；时间：30 min；pH：7.0–7.2
2.2 基因敲除突变株与回补菌株的构建
通过pK18km介导的双同源重组在菌株Y-9中构建nirB和nirD基因的框内缺失突变株。具体步骤如下：扩增靶基因的上、下游侧翼区域，通过重叠延伸PCR融合，随后克隆至pK18km载体。重组质粒先转化至大肠杆菌DH5α进行验证，再电转化入菌株Y-9。基因敲除突变株通过卡那霉素抗性（50 µg/mL）和蔗糖反向筛选（5% w/v）进行筛选。
回补菌株构建中，nirB和nirD的编码序列（不含天然启动子）通过含pBBR1MCS-2同源臂的引物进行PCR扩增，使用ClonExpress II一步克隆试剂盒（Vazyme Biotech Co., Ltd.，南京，中国）克隆至该广宿主载体。回补菌株中基因表达由pBBR1MCS-2上的lac启动子驱动，培养过程中不添加诱导剂。回补质粒电转化入相应敲除突变株，转化子在含50 µg/mL Km的LB琼脂平板上筛选。本研究所用菌株、质粒和引物列于表S1和S2。
【数据】抗生素浓度：卡那霉素50 µg/mL；蔗糖浓度：5% w/v；试剂盒：ClonExpress II（Vazyme）
2.3 野生型、突变株与回补菌株的氮转化比较分析
将野生型、突变株和回补菌株的单菌落分别接种至LB培养基，培养至对数期。菌体通过离心收集（6000 rpm，5 min），用无菌水洗涤两次，重悬于100 mL含不同氮源的培养基（NM、DM-1或DM-2）中，置于250 mL锥形瓶。培养条件为15°C、150 rpm振荡培养4 d。在该条件下，溶解氧（DO）浓度维持在6.90 ± 0.25 mg/L。定期监测细菌生长（OD600）、pH以及总氮（TN）、NH4+、NO3–和NO2–浓度。每个处理设置三次重复，以无菌不接种培养基作为阴性对照。
【数据】离心：6000 rpm，5 min；培养体积：100 mL；温度：15°C；转速：150 rpm；时间：4 d；DO：6.90 ± 0.25 mg/L
2.4 15N同位素示踪分析
为区分DNRA与潜在的细胞有机氮矿化作用，菌株在补充氯霉素的15N标记NO2–培养基中培养。菌株首先在无15N的DM-2培养基中培养至对数生长期（36 h），然后收集、洗涤并重悬于含15N标记NaNO2（15原子%）和氯霉素（200 mg/L）的培养基中。培养物在15°C、150 rpm振荡培养3 h，期间DO浓度维持在6.90 ± 0.25 mg/L。通过氯霉素抑制细胞生长，有效排除15NO2–的同化利用及后续矿化，因此检测到的任何胞外15NH4+只能来自15NO2–的异化还原。样品分析包括OD600、NO2–和NH4+浓度、氮化合物中15N同位素丰度以及细菌细胞中15N的掺入量。所有实验设三次重复，以无菌培养基作为阴性对照。
【数据】氯霉素浓度：200 mg/L；15N丰度：15原子%；培养时间：36 h（预培养）+ 3 h（示踪）；温度：15°C；转速：150 rpm；DO：6.90 ± 0.25 mg/L
2.5 氮代谢相关基因的表达分析
对处于对数生长期的野生型、突变株和回补菌株细胞进行RNA提取和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析。总RNA使用Trizol RNA提取试剂盒（Thermo Fisher Scientific Inc.，Carlsbad，美国）提取，并用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific Inc.，Carlsbad，美国）定量。cDNA合成使用SweScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis Kit（Servicebio Technology Co., Ltd.，武汉，中国），qRT-PCR使用LightCycler 480 II系统（Roche Diagnostics GmbH，Basel，瑞士）和2 × Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix（Servicebio Technology Co., Ltd.，武汉，中国）。引物序列见表S3。基因表达采用2-ΔΔCT方法定量，所有分析设三次重复。
【数据】仪器：NanoDrop 2000、LightCycler 480 II；方法：2-ΔΔCT；重复数：3
2.6 分析方法
培养液中的TN含量采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法测定。样品经8000 rpm离心5 min后，取上清分别采用靛酚蓝法、盐酸分光光度法和N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法测定NH4+、NO3–和NO2–浓度。所有氮素测定使用T6-1650E分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司，北京，中国）。OD600在600 nm波长下测定，pH使用S220 pH计（Mettler-Toledo Instruments，上海，中国）测定。DO浓度使用便携式溶氧仪（AR8210，万创电子制品有限公司，东莞，中国）监测。NH4+、NO3–、NO2–和细菌细胞中15N丰度的同位素分析由上海化工研究院有限公司采用同位素质谱仪（A001Nu和A002MAT271）完成。氮去除效率按Rv =（T1 – T2）/ T1 × 100%计算，其中Rv为去除效率，T1和T2分别为初始和最终氮浓度（mg/L）。TN损失和生物量氮按以下公式计算：TN损失（mg/L）= 初始TN – 最终TN；生物量氮（mg/L）=（初始NO3– + 初始NO2– + 初始NH4+）–（最终NO3– + 最终NO2– + 最终NH4+）– TN损失。
【数据】离心：8000 rpm，5 min；仪器：T6-1650E分光光度计、S220 pH计、AR8210溶氧仪、A001Nu和A002MAT271质谱仪
2.7 统计分析
统计分析使用Microsoft Excel 2016和SPSS Statistics 25完成，数据可视化使用Origin 2018。所有数据以平均值±标准差（SD）表示。组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey事后多重比较检验。统计学显著性定义为P < 0.05。
【数据】统计方法：单因素方差分析 + Tukey事后检验；显著性阈值：P < 0.05
研究结果
3.1 nirB和nirD突变株及回补菌株的构建与验证
通过双同源重组构建了菌株Y-9的nirB和nirD敲除突变株（ΔnirB和ΔnirD），并经PCR验证（图1A）。qPCR分析显示，ΔnirB中nirB表达量降至野生型的0.0001倍（图2A），ΔnirD中nirD表达量降至野生型的0.01倍（图2B）。极低的残留转录水平可能源于框内缺失保留了部分基因序列，仍可被qPCR引物检测到。然而，这些极低的表达水平表明功能基因活性已被有效消除。
随后通过将pBBR-nirB和pBBR-nirD质粒分别导入相应突变株构建回补菌株（图1B、C）。回补菌株中基因表达完全恢复（图2A、B），确认回补成功。
【数据】ΔnirB中nirB表达：野生型的0.0001倍；ΔnirD中nirD表达：野生型的0.01倍
3.2 nirB和nirD对恶臭假单胞菌Y-9的NO2–还原均不可或缺
#### 3.2.1 nirB或nirD缺失 abolish NO2–还原并导致NO2–积累
为阐明nirB和nirD在氮转化中的具体作用，以NO3–和NO2–为氮源进行培养实验，表征菌株生长、氮代谢和基因表达。在NO3–培养基中培养4 d后，ΔnirB和ΔnirD突变株均表现出严重受损的生长，OD600值分别为0.37和0.27，而野生型为0.81（图3D）。
野生型菌株Y-9对NO3–的去除效率达到87%，NH4+产量为5.95 mg/L，且未检测到NO2–积累（图3A–C）。相比之下，ΔnirB和ΔnirD突变株积累了大量的NO2–（分别为35.69和28.38 mg/L），NH4+未检出，尽管NO3–去除率分别达到77%和61%（图3A–C）。野生型培养物中pH从7.25升至9.08，TN减少7.56 mg/L；而ΔnirB和ΔnirD突变株pH变化极小（分别从7.23升至7.52和从7.23升至7.48），TN减少量也较低，分别为1.28和0.43 mg/L（图3E、F）。观察到的TN减少代表从培养系统中损失的氮，可能包含反硝化产生的气态损失以及高pH下非生物氨挥发等其他过程。精确定量这些通量需要未来研究中使用15N同位素示踪和直接气体分析。
氮平衡分析显示，野生型培养物中消耗的NO3–主要转化为生物量氮（34.28 mg/L），而ΔnirB和ΔnirD突变株中生物量氮大幅减少（分别为5.24和1.22 mg/L），大部分消耗的NO3–以NO2–形式积累（表S4）。这些观察结果与此前报道的Y-9 ΔnirBD突变株表型一致。其他细菌物种的ΔnirB突变株也有类似报道，包括Synechococcus sp. PCC7942、Mycobacterium tuberculosis和Anabaena sp.。
以NO2–为唯一氮源的进一步验证实验确认了两个基因的关键作用（图4）。培养4 d后，野生型菌株Y-9实现了97%的NO2–去除率，生长旺盛（OD600 = 0.79），NH4+产量为7.44 mg/L（图4A–C）。与此形成鲜明对比的是，ΔnirB和ΔnirD突变株几乎不生长（OD600仅增加0.20和0.16），无法还原NO2–，NH4+未检出（图4A–C）。ΔnirB和ΔnirD突变株中pH从7.20分别仅升至7.39和7.38（野生型从7.20升至9.10），TN分别仅减少3.23和2.94 mg/L（野生型减少8.23 mg/L）（图4D、E）。
这些结果与此前在大肠杆菌中的发现一致——nirB或nirD任一基因缺失都会导致NADH依赖性亚硝酸盐还原酶活性完全丧失；在结核分枝杆菌中，nirB缺失完全消除NO2–还原。这表明nirB和nirD在细菌NO2–还原中具有保守且必需的作用。然而，Yılmaz等人（2022）报道纯化的NirB单独在体外即表现出亚硝酸盐还原酶活性，表明NirD的功能需求在体内和体外条件下可能不同。
qPCR分析显示，ΔnirB突变株中nirD表达上调11.21倍，而ΔnirD突变株中nirB表达增加17.10倍（图2A、B）。此外，编码硝酸盐还原酶的napA和narG显著上调：ΔnirB中napA增加3.40倍，ΔnirD中增加138.24倍；narG分别增加13.13倍和247.74倍（图2C、D）。尽管存在这种显著的转录响应，剩余基因的上调无法补偿nirB或nirD缺失造成的功能丧失，证实两个基因对NO2–还原各自不可或缺。观察到的转录扩增可能代表对NO2–积累和NH4+缺乏的应激响应，而由此产生的NO2–积累可能通过氧化应激或能量代谢紊乱进一步损害细胞功能。
【数据】NO3–培养基：野生型OD600 = 0.81、NO3–去除率87%、NH4+产量5.95 mg/L、NO2–积累未检出、pH 7.25→9.08、TN减少7.56 mg/L；ΔnirB：OD600 = 0.37、NO3–去除率77%、NO2–积累35.69 mg/L、pH 7.23→7.52、TN减少1.28 mg/L；ΔnirD：OD600 = 0.27、NO3–去除率61%、NO2–积累28.38 mg/L、pH 7.23→7.48、TN减少0.43 mg/L；生物量氮：野生型34.28 mg/L、ΔnirB 5.24 mg/L、ΔnirD 1.22 mg/L；NO2–培养基：野生型NO2–去除率97%、OD600 = 0.79、NH4+产量7.44 mg/L、TN减少8.23 mg/L、pH 7.20→9.10；ΔnirB和ΔnirD OD600仅增加0.20和0.16、TN减少3.23和2.94 mg/L、pH升至7.39和7.38；基因表达上调：ΔnirB中nirD 11.21倍、ΔnirD中nirB 17.10倍；napA：ΔnirB中3.40倍、ΔnirD中138.24倍；narG：ΔnirB中13.13倍、ΔnirD中247.74倍
#### 3.2.2 nirB或nirD回补恢复NO2–还原但效率存在差异
在NO3–培养基中，ΔnirB（pBBR-nirB）和ΔnirD（pBBR-nirD）回补菌株均恢复旺盛生长，4 d时OD600分别达到0.90和0.91，TN消耗量与野生型相当（图3D、F）。然而，它们的NO2–还原能力存在显著差异。
ΔnirD（pBBR-nirD）回补菌株实现了近乎完全的功能恢复：NO3–去除率86%，无NO2–积累，NH4+产量（7.47 mg/L）超过野生型水平（图3A–C）。在NO2–培养基中，该菌株在2 d内完全去除了44.69 mg/L的NO2–（图4A）。
相比之下，ΔnirB（pBBR-nirB）回补菌株仅表现出部分恢复。尽管实现了较高的NO3–去除效率（超过99%），但仍残留14.08 mg/L的NO2–，NH4+产量降低（3.05 mg/L，仅为野生型的51%）（图3A–C）。在NO2–培养基中，NO2–去除效率仅为65%，NH4+积累量极低（1.20 mg/L）（图4A、B）。
qPCR分析显示，ΔnirD（pBBR-nirD）回补菌株中nirD和nirB表达分别上调845.71倍和11.82倍（图2A、B）。相比之下，ΔnirB（pBBR-nirB）回补菌株中nirB表达急剧增加（862.60倍），而nirD表达仍处于低水平（仅1.73倍）（图2A、B）。
对纯化细胞质亚硝酸盐还原酶的生化表征表明，该酶以NirB-NirD复合体形式发挥功能，需要各亚基之间保持适当的化学计量比。因此，回补菌株中nirB过表达862.60倍而nirD表达不足（仅1.73倍），可能限制体内功能性酶复合体的形成，从而影响催化效率。
为检验不完全恢复是否由NirD缺乏导致的复合体组装受损所致，构建了ΔnirBD双敲除突变株及其回补菌株ΔnirBD（pBBR-nirBD）（图S1）。如果不完全恢复确实由NirD缺乏导致的复合体组装受损引起，那么两个基因的共表达应显著改善表型。然而，ΔnirBD（pBBR-nirBD）仅实现62%的NO2–去除率，NH4+产量为1.15 mg/L，与ΔnirB（pBBR-nirB）相当（65%和1.20 mg/L）（表S5，图4A、4B）。两株菌观察到的相似恢复水平表明，nirB和nirD的共表达并未显著提高回补效率，从而排除了NirD缺乏导致的复合体组装受损是不完全恢复的主要原因。相反，这些结果表明限制因素在于基于质粒的表达系统本身。
【数据】NO3–培养基回补菌株：ΔnirB（pBBR-nirB）OD600 = 0.90、NO3–去除率>99%、残留NO2– 14.08 mg/L、NH4+产量3.05 mg/L（野生型的51%）；ΔnirD（pBBR-nirD）OD600 = 0.91、NO3–去除率86%、无NO2–积累、NH4+产量7.47 mg/L；NO2–培养基：ΔnirD（pBBR-nirD）2 d内完全去除44.69 mg/L NO2–；ΔnirB（pBBR-nirB）NO2–去除率65%、NH4+ 1.20 mg/L；ΔnirBD（pBBR-nirBD）NO2–去除率62%、NH4+ 1.15 mg/L；基因表达：ΔnirD（pBBR-nirD）中nirD上调845.71倍、nirB上调11.82倍；ΔnirB（pBBR-nirB）中nirB上调862.60倍、nirD仅1.73倍
3.3 nirB和nirD缺失对NH4+同化的影响
在NH4+培养基中，ΔnirB和ΔnirD突变株的生长与野生型相当，但总氮去除能力降低，同时glnA表达上调（分别为3.39倍和2.00倍）（图5）。
【数据】NH4+培养基：ΔnirB中glnA表达上调3.39倍；ΔnirD中glnA表达上调2.00倍
讨论与解读
本研究通过遗传学和同位素示踪证据表明，在恶臭假单胞菌Y-9中，nirB和nirD对NO2–还原各自不可或缺且功能不可冗余，共同介导好氧条件下的ANRA和DNRA途径。此外，nirB或nirD任一基因缺失都会影响NH4+同化，表明它们的影响范围超出NO2–还原，延伸至更广泛的氮代谢过程。
值得注意的是，单基因缺失触发另一基因的强烈上调（11.21至17.10倍），同时硝酸盐还原酶基因napA和narG也大幅上调——但这种转录层面的代偿响应远不足以恢复NO2–还原能力。回补实验揭示了不对称的恢复效率：nirD回补株几乎完全恢复，而nirB回补株仅部分恢复，且双基因共表达并未改善效果，指向质粒表达系统本身的局限性而非亚基组装问题。
编译者解读：该研究在合成生物学应用层面有两点启示。其一，nirB/nirD双基因功能不可冗余的结论提示，在设计用于氮循环调控的工程菌株时，不能简单认为敲除一个基因就能被另一基因的转录上调所代偿——基因编辑策略需同时考虑两个位点。其二，回补实验中nirB过表达862倍而nirD仅1.73倍导致的恢复不完全，为异源表达系统中多亚基酶的化学计量比优化提供了反面教材——过表达单一亚基不仅浪费资源，还可能因复合体组装失衡而限制整体催化效率。这一发现对构建高效的氮素同化工程菌具有直接指导意义。未来若能在蛋白水平解析NirBD复合体的组装机制和好氧DNRA的生化基础，将有助于开发更精准的氮管理生物工具。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134621
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134621