来源：Engineered Bacillus subtilis secreting piscidin-1/hepcidin enhances resistance against Aeromonas hydrophila in a zebrafish model（Fish & Shellfish Immunology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
抗菌肽（AMPs）在水产养殖中的应用受限于稳定性差与递送效率低。本研究将罗非鱼来源的piscidin-1与hepcidin分别克隆至枯草芽孢杆菌168（BS168）表达载体，构建了木糖诱导型工程菌BS168-sfGFP-piscidin与BS168-sfGFP-hepcidin，并进一步构建串联双抗菌肽表达菌株BS168-sfGFP-PH。体外实验证实三种工程菌均显著抑制嗜水气单胞菌生长；斑马鱼口服实验显示，BS168-sfGFP-PH组在攻毒后存活率最高，其保护机制涉及降低肠道病原载量、抑制炎症反应并改善肠道完整性。该研究为水产养殖细菌感染防控提供了可口服递送抗菌肽的益生菌策略。
研究背景
集约化水产养殖通过高密度放养与配合饲料显著提升了单位水体的产量，但同时也促进了包括气单胞菌属、弧菌属、无乳链球菌及格氏乳球菌在内的细菌病原体增殖，增加了疾病暴发风险。集约化养殖带来的慢性应激与免疫抑制进一步提高了水生动物对感染的易感性，造成巨大经济损失。以嗜水气单胞菌为例，其每年在中国和美国造成数百万尾养殖鲤鱼与鲶鱼的损失。在抗生素滥用限制日益严格的背景下，亟需开发安全有效的替代防控策略。疫苗虽对特定物种有效，但商业化疫苗适用范围有限，且腹腔注射不适用于鱼苗或小型鱼类，高效疫苗的开发还受制于高成本与长周期。抗菌肽因其广谱抗菌活性被视为有前景的抗生素替代方案，但其在养殖中的应用受限于稳定性差、递送效率低。枯草芽孢杆菌作为益生菌底盘，兼具蛋白分泌能力强与安全性高的优势，为抗菌肽的口服递送提供了可行路径。
研究方法
2.1 培养基、菌株与培养条件
本研究所用菌株与质粒分别列于补充表S1和S2。所有菌株均在LB培养基（10 g/L氯化钠、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物）中培养。
【数据】培养基：LB（10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物）；菌株与质粒：详见补充表S1、S2
2.2 重组DNA操作与遗传技术
本研究所用引物列于补充表S3。质粒构建采用Gibson assembly方法。构建质粒的序列通过Sanger测序确认（擎科，中国）。重组质粒通过Spizizen转化法转入枯草芽孢杆菌168 [40]。
【数据】方法：Gibson assembly；测序：Sanger测序；转化：Spizizen转化法
2.3 重组抗菌肽的鉴定
采用Western blotting检测无细胞培养上清液及超声破碎细菌细胞中重组抗菌肽（rAMPs）的表达。一抗为anti-his（1:1000稀释，Abconal，中国），二抗为anti-mouse IgG HRP（1:5000稀释，LI-COR，美国）。
【数据】一抗：anti-his（1:1000）；二抗：anti-mouse IgG HRP（1:5000）；检测样品：无细胞培养上清液与超声破碎细胞
2.4 体外抗菌活性测定
#### 2.4.1 琼脂孔扩散实验
嗜水气单胞菌在LB肉汤中培养至OD600约0.6–0.8，取100 μL菌悬液（无菌PBS中1 × 10⁷ CFU/mL）与LB琼脂平板混合。平板打孔，孔径9 mm。随后，将相同浓度（200 μL，10⁸ CFU/mL）的BS168-sfGFP-piscidin、BS168-sfGFP-hepcidin及BS168-con（pSTOP1622转化BS168，不含rAMPs）培养物分别加入孔中。每种工程菌设置3个孔。37°C培养24 h后测量抑菌圈直径。
【数据】菌株浓度：10⁸ CFU/mL（200 μL/孔）；病原菌浓度：1 × 10⁷ CFU/mL；孔径：9 mm；温度：37°C；时间：24 h；重复：3孔/菌株
#### 2.4.2 浊度分析
纯化的嗜水气单胞菌在LB肉汤中于37°C培养至对数中期。将菌液等分，分别与20 μM rAMPs或等体积无菌PBS混合。所有样品于37°C培养，每3小时间隔记录OD600，持续9 h。每个处理设置3个独立重复。
【数据】rAMP浓度：20 μM；培养温度：37°C；监测时长：9 h（间隔3 h）；重复：3个独立重复
2.5 蛋白质三维结构建模与分析
sfGFP-PH的3D结构模型获取自AlphaFold蛋白质结构数据库（https://alphafold.ebi.ac.uk/）。所得结构使用PyMOL程序进行可视化。
【数据】结构数据库：AlphaFold Protein Structure Database；可视化工具：PyMOL
2.6 动物实验
#### 2.6.1 实验动物
初始体长1.5 ± 0.5 cm的斑马鱼用于本研究。饲养期间水温维持在28.5°C，光照周期为12 h光照/12 h黑暗。
【数据】斑马鱼体长：1.5 ± 0.5 cm；水温：28.5°C；光照周期：12 h光照/12 h黑暗
#### 2.6.2 病原攻毒实验
共计360尾斑马鱼随机分为4个处理组。经过7天适应期后，鱼接受以下处理7天：基础饲料混合（1）BS168-con（CON组；10⁸ CFU/g；n = 90）、（2）BS168-sfGFP-piscidin（10⁸ CFU/g；n = 90）、（3）BS168-sfGFP-hepcidin（10⁸ CFU/g；n = 90）、（4）BS168-sfGFP-PH（串联Piscidin-1/Hepcidin，10⁸ CFU/g；n = 90）。随后，斑马鱼每周接受一次浸浴攻毒，连续4周，每次在107 CFU/mL嗜水气单胞菌中暴露48 h。攻毒期间持续维持重组菌悬液与木糖。记录各组存活率。实验结束时，收集肠道组织与内容物用于分析。
【数据】斑马鱼总数：360尾；分组：4组（n = 90/组）；饲料添加量：10⁸ CFU/g；攻毒浓度：10⁷ CFU/mL；攻毒时长：48 h/次；攻毒频率：每周1次，连续4周；适应期：7天；给药期：7天
#### 2.6.3 嗜水气单胞菌绝对定量
采用已建立的针对嗜水气单胞菌特异性序列的qPCR方法定量斑马鱼肠道内嗜水气单胞菌 [41]。引物合成列于补充表S4。扩增片段克隆至pMD™19-T载体（Takara #6013），重组质粒DNA使用Omega E.Z.N.A.®质粒提取试剂盒（D6943-02）提取。以10倍梯度稀释（10²–10⁸拷贝/μL）的重组质粒建立标准曲线（R² > 0.99，效率95–105%）。肠道内容物总DNA使用TIANamp Micro DNA Kit（DP316，天根）提取，通过SYBR Green qPCR（QuantStudio 5）结合标准曲线定量气溶素基因拷贝数（n = 9）。统计分析使用GraphPad Prism 9.0软件。
【数据】标准曲线范围：10²–10⁸拷贝/μL；R² > 0.99；扩增效率：95–105%；样本量：n = 9；qPCR仪器：QuantStudio 5
#### 2.6.4 实时荧光定量PCR（qPCR）
使用TRIzol试剂（Invitrogen，美国）提取斑马鱼肠道组织RNA。RNA浓度及A260/280比值使用NanoDrop测定。RNA的数量和完整性通过琼脂糖凝胶电泳分析。逆转录使用HiScript IV RT SuperMix（R423，诺唯赞生物科技有限公司，中国），按厂家说明书操作。模式识别受体（tlr4和nlrb1）、接头蛋白（myd88和trif）、信号分子（mapk、fos、jun、traf6、ripk2和ikbkb）、促炎细胞因子（tnfα、il-1β）及抗炎介质（il-10、il-22）的mRNA表达水平通过SYBR Green实时qPCR定量（n = 9）。qPCR反应体系含1 μL cDNA、1 μL 0.2 μM正反向引物、5 μL SYBR Green Master Mix及3 μL无RNase/DNase水。以延伸因子-1 alpha（ef1α）为内参基因，采用2^−ΔΔCT方法计算目标基因相对表达量 [42]。引物序列列于补充表S5。
【数据】qPCR体系：cDNA 1 μL、引物各1 μL（0.2 μM）、SYBR Green Master Mix 5 μL、无核酸酶水3 μL；内参基因：ef1α；计算方法：2^−ΔΔCT；样本量：n = 9
#### 2.6.5 形态学分析
病原攻毒实验结束后，收集饲喂BS168-con和BS168-sfGFP-PH的斑马鱼肠道，用多聚甲醛固定。采用苏木精-伊红（H&E）染色分析前肠组织学。使用Leica显微镜（BX51，日本）及Leica Application Suite软件采集图像。形态学测量使用Image J软件（n = 3）。
【数据】固定液：多聚甲醛；染色：H&E；显微镜：Leica BX51；图像分析：Image J；样本量：n = 3
2.7 统计分析
统计分析使用GraphPad Prism 9.0软件。所有数据以平均值 ± 标准误（SEM）表示。两组间差异采用Student's t检验评估。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。所有统计检验中，p值小于0.05视为具有统计学显著性。
【数据】统计软件：GraphPad Prism 9.0；数据表示：均值 ± SEM；组间比较：t检验；多组比较：单因素ANOVA；显著性阈值：p < 0.05
研究结果
3.1 利用sfGFP融合标签介导抗菌肽在枯草芽孢杆菌中的调控性分泌表达
为便于两种抗菌肽Piscidin-1和Hepcidin的肠道递送，通过非整合型质粒系统对枯草芽孢杆菌进行了异源表达工程改造。sfGFP蛋白与各肽段融合以调节其胞外分泌，并在C端加入His标签以便检测（图1A）。表达受PxylA启动子控制，可通过外源木糖精确诱导。基于体外剂量反应实验，1.5%木糖被选为最佳诱导浓度（图S1）。按照图1B所示策略构建了质粒pSTOP1622-sfGFP-piscidin和pSTOP1622-sfGFP-hepcidin。重组质粒转化至枯草芽孢杆菌168后，用引物SPST-F/SPST-R对转化子进行PCR筛选，以确认抗菌肽基因的插入。结果显示，BS168-sfGFP-piscidin扩增出约1211-bp片段，BS168-sfGFP-hepcidin扩增出1309-bp片段，而携带空载体的阴性对照扩增出342-bp片段（图1C），证实BS168-sfGFP-piscidin和BS168-sfGFP-hepcidin构建成功。
【数据】最佳木糖诱导浓度：1.5%；PCR片段大小：piscidin 1211 bp、hepcidin 1309 bp、空载体对照 342 bp
3.2 BS168-sfGFP-piscidin和BS168-sfGFP-hepcidin的体外表达分析与抗菌活性评估
通过全细胞绿色荧光观察和Western blot分析验证了rAMPs的表达。BS168-sfGFP-piscidin和BS168-sfGFP-hepcidin在蓝光下表现出强烈的绿色荧光（图S2）。BS168-sfGFP-piscidin和BS168-sfGFP-hepcidin超声破碎上清液的Western blot分析显示，出现预期大小的清晰免疫反应条带，包括His标签融合蛋白sfGFP-piscidin（34.1 kDa）和sfGFP-hepcidin（35.4 kDa）（图2A），证实了这些蛋白的成功表达。
为评估工程菌对嗜水气单胞菌的抗菌活性，采用琼脂孔扩散实验。BS168-con周围未见明显抑菌圈。相比之下，BS168-sfGFP-piscidin和BS168-sfGFP-hepcidin对嗜水气单胞菌的抑菌圈显著扩大（p < 0.0001，±SEM）（图2B），表明这些工程菌具有抗菌活性。
为确认rAMPs的功能，通过Ni-NTA亲和层析纯化了sfGFP-piscidin和sfGFP-hepcidin（图S3和S4），并通过浊度分析评估其对嗜水气单胞菌的抗菌活性。结果显示，与PBS相比，两种rAMPs在9 h内均有效抑制了嗜水气单胞菌的生长（图2C）。接种后6 h的活菌计数显示，任一rAMP处理样品的菌落密度均显著低于对照组（p < 0.0001，±SEM）（图2D）。这些结果表明，表达rAMPs的工程菌在体外对嗜水气单胞菌具有显著的抗菌活性。
【数据】sfGFP-piscidin分子量：34.1 kDa；sfGFP-hepcidin分子量：35.4 kDa；抑菌圈差异：p < 0.0001；活菌计数差异（6 h）：p < 0.0001；抗菌监测时长：9 h
3.3 表达串联抗菌肽的BS168-sfGFP-PH的构建与体外评估
BS168-sfGFP-piscidin和BS168-sfGFP-hepcidin的抗菌活性促使我们进一步研究其叠加抑菌效果。因此，将Piscidin-1和Hepcidin通过肠激酶位点连接子融合，N端为sfGFP，C端为His标签。将该序列克隆至pSTOP1622构建pSTOP1622-sfGFP-PH（图3A）。使用引物SPST-F/SPST-R进行PCR验证，成功扩增出预期的1501 bp片段，确认工程菌BS168-sfGFP-PH构建成功（图3B）。通过全细胞绿色荧光观察，BS168-sfGFP-PH在蓝光下表现出强烈的绿色荧光（图S5）。BS168-sfGFP-PH超声破碎上清液和无细胞培养上清液的Western blot分析均显示约42.6 kDa的条带（图3C），验证了串联抗菌肽在BS168-sfGFP-PH中的成功表达和高效胞外分泌。
使用琼脂孔扩散实验评估BS168-sfGFP-PH对嗜水气单胞菌的抗菌活性，并与BS168-sfGFP-piscidin和BS168-sfGFP-hepcidin进行比较。与预期相反，与BS168-con相比，BS168-sfGFP-piscidin、BS168-sfGFP-hepcidin和BS168-sfGFP-PH的抑菌圈均扩大（p < 0.0001，±SEM）。但基于抑菌圈，BS168-sfGFP-PH与BS168-sfGFP-piscidin或BS168-sfGFP-hepcidin相比无显著差异（p > 0.05，图3D）。AlphaFold结构建模表明，未经处理的串联抗菌肽的构象与其各自对应物明显不同（图3E），这影响了串联抗菌肽体外的抗菌活性。基于这些发现，我们聚焦于BS168-sfGFP-PH的体内功能表征。
【数据】串联构建PCR片段：1501 bp；串联融合蛋白分子量：42.6 kDa；vs单抗菌肽抑菌圈差异：p > 0.05（无显著差异）
3.4 BS168-sfGFP-PH在嗜水气单胞菌攻毒下提高斑马鱼存活率
在体内评估了rAMPs的诱导表达。饲粮补充BS168-sfGFP-PH 3天后，口服补充1.5%木糖可在6 h内于斑马鱼肠道中检测到荧光，证实了rAMPs在体内诱导成功（图S6）。进一步检测了三种工程菌控制嗜水气单胞菌感染的效果。工程菌饲粮补充7天后，鱼接受嗜水气单胞菌攻毒。存活分析显示，BS168-sfGFP-PH与BS168-con、BS168-sfGFP-piscidin和BS168-sfGFP-hepcidin相比提供了显著更高的保护效率（图4A和B），证明了表达串联抗菌肽菌株的治疗潜力。
【数据】体内诱导时间：3天饲喂后+6 h；木糖浓度：1.5%；攻毒前饲喂时间：7天
3.5 口服BS168-sfGFP-PH调控嗜水气单胞菌诱导的肠道炎症水平
在体内评估了工程菌对肠道内嗜水气单胞菌的直接杀菌能力。基于qPCR绝对定量的分析显示，口服BS168-sfGFP-piscidin和BS168-sfGFP-PH可降低肠道内病原体基因拷贝数（图5A）。BS168-sfGFP-PH通过体内诱导的串联rAMPs表现出最佳的杀菌活性，差异极显著（p < 0.0001，t检验）。
肠道细胞表面的模式识别受体（PRRs）可被革兰氏阴性病原体的病原体相关分子模式（PAMPs）激活。相对mRNA表达水平分析显示，与BS168-con组相比，饲喂BS168-sfGFP-PH的斑马鱼肠道组织中tlr4（p = 0.0324，t检验）和nlrb1（p = 0.0478，t检验）表达较低（图5B）。相比之下，饲喂另外两种工程菌对这些PRRs无显著影响。
因此，进一步评估了BS168-sfGFP-PH组的接头蛋白和信号分子。结果表明，myd88（p = 0.0225，t检验）、fos（p = 0.0279，t检验）、traf6（p = 0.0079，t检验）、jun（p = 0.0408，t检验）和ikbkb（p = 0.0343，t检验）的表达水平显著受抑制，提示p38 MAPK和NF-κB信号通路的激活被广泛抑制（图5C）。
随后对细胞因子进行了评估。结果显示，与饲喂BS168-con的鱼相比，肠道il-10水平上调（p = 0.0158，t检验），而tnfα水平下调（p = 0.0209，t检验）。il-22也观察到增加趋势，而il-1β呈下降趋势（图5D）。
为分析BS168-sfGFP-PH的可能效应，进行了组织学分析（图5E）。结果表明，口服BS168-sfGFP-PH显著增加了肌层厚度（MT）。
【数据】肠道病原基因拷贝数降幅：BS168-sfGFP-PH组p < 0.0001（t检验）；tlr4：p = 0.0324；nlrb1：p = 0.0478；myd88：p = 0.0225；fos：p = 0.0279；traf6：p = 0.0079；jun：p = 0.0408；ikbkb：p = 0.0343；il-10：p = 0.0158（上调）；tnfα：p = 0.0209（下调）
讨论与解读
水产养殖中长期使用抗生素控制病原感染，但加剧了生态风险并加速耐药菌株的出现。抗菌肽被视为有前景的替代策略。本研究将枯草芽孢杆菌工程化为鱼类来源抗菌肽的可调控表达系统，建立了提高鱼类抗细菌病原体存活率的口服递送益生菌。水产养殖中传统益生菌底盘主要包括乳酸菌（LAB）和芽孢杆菌属。以LAB作为底盘细胞面临重组蛋白表达水平低、质粒不稳定、缺乏类真核翻译后修饰等显著局限。本研究最初选用乳酸乳球菌作为底盘，但所得工程菌表达水平极低（数据未显示）。相比之下，枯草芽孢杆菌拥有特殊的硫氧还蛋白还原酶系统，可高效催化二硫键形成，实现富含二硫键肽段的稳健表达。枯草芽孢杆菌已成功用于在哺乳动物中表达和递送Cecropin AD、Cecropin B及LR-LFCA等抗菌肽，兼具抗菌与益生菌双重效益。本研究中，基于BS168的工程菌表达的重组抗菌肽表现出强效抗菌活性，证明枯草芽孢杆菌可作为抗菌肽口服递送的有效底盘。
编译者解读
本研究的技术亮点在于采用sfGFP融合标签策略——既作为分泌报告系统又作为可溶性增强标签，解决了抗菌肽在异源宿主中易被降解的核心难题。木糖诱导的严格调控表达避免了组成型表达可能带来的代谢负担与毒性。串联表达策略尽管体外未显示叠加效应（结构建模提示构象改变可能遮蔽活性位点），体内却表现出最优保护效果，提示融合蛋白在肠道环境中可能被蛋白酶切割释放活性肽段。这一"体外不显著、体内显著"的反差提示，体外活性筛选未必能准确预测体内疗效，体内验证不可或缺。局限在于斑马鱼模型与商业鱼种间的外推仍需谨慎，且工程菌在肠道中的定植时间与分泌动力学有待进一步优化。从合成生物学应用看，该"诱导型分泌表达+口服益生菌递送"平台具备模块化特征，理论上可快速替换为其他目标抗菌肽以应对不同病原威胁，具有较好的可扩展性。
参考来源
Zhang, K.-Y. Engineered Bacillus subtilis secreting piscidin-1/hepcidin enhances resistance against Aeromonas hydrophila in a zebrafish model. Fish & Shellfish Immunology, 2026. DOI: 10.1016/j.fsi.2026.111447
DOI: 10.1016/j.fsi.2026.111447