来源：Systematic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient synthesis of Lolium perenne antifreeze protein（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
抗冻蛋白在生物样本低温保存与食品保鲜领域具有重要应用价值，但异源表达产量低一直是产业化瓶颈。本研究利用合成染色体重排与LoxP介导进化（SCRaMbLE）系统，对酿酒酵母进行多轮迭代改造，结合基因组与转录组多组学分析，鉴定了TIF2与NPP2等关键工程靶点。通过组合代谢工程与5 L发酵罐补料分批发酵，最终实现黑麦草抗冻蛋白（LpAFP）1.9 g/L的产量——这是迄今报道的最高水平。
研究背景
抗冻蛋白是一类具有热滞活性、冰重结晶抑制活性和冰晶形态修饰功能的生物大分子。其中，冰重结晶抑制能力对生物样本低温储存和食品保鲜尤为关键。已知抗冻蛋白中，来自黑麦草（Lolium perenne）的LpAFP表现出优异的冰重结晶抑制活性，甚至在100°C加热后仍保持功能。然而，LpAFP在天然系统中的产量低，提取过程复杂且成本高昂。利用工程微生物进行异源表达是缓解上述限制的可行策略——已有研究在甲醇利用型毕赤酵母中表达LeuAFP达到443 mg/L（7 L发酵罐），在毕赤酵母中表达胡萝卜抗冻蛋白达到379.47 mg/L，在大肠杆菌中表达冬鲽抗冻蛋白达到10 mg/L。但LpAFP的高效异源合成仍缺乏系统性解决方案。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
质粒转化与克隆在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行，培养于LB培养基（10 g/L蛋白胨、5 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物）。酿酒酵母菌株yFJ440作为本研究DNA转化与组装的初始宿主，培养于YPD培养基（20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物）、SC-His培养基（缺组氨酸，含20 g/L葡萄糖）、SC-Gal培养基（缺组氨酸，含20 g/L半乳糖）及5-氟乳清酸（5-FOA）培养基（完全培养基含20 g/L葡萄糖和1 g/L 5-FOA）。本研究所用全部质粒、菌株和引物列于表S1、表S2和表S3（见补充材料）。
【数据】培养基：LB/YPD/SC-His/SC-Gal/5-FOA；葡萄糖：20 g/L；半乳糖：20 g/L；5-FOA：1 g/L
2.2 倍增时间计算
挑取单菌落接种于5 mL SC-His培养基（30°C，220 rpm，12 h）。将培养物转接至新鲜SC-His培养基并生长至OD600为0.1，随后转移至96孔荧光板。平板于30°C、220 rpm持续振荡培养。每2小时测量OD600，每次测量前平板振荡30 s。倍增时间（DT）按以下公式计算：倍增时间 = 时长 × Log(2) / [Log(终浓度) − Log(初浓度)]。在线计算DT的网站为 https://www.doubling-time.com/compute.php。
【数据】温度：30°C；转速：220 rpm；时间：12 h；OD600初值：0.1；测量间隔：2 h
2.3 SCRaMbLE与致死率测定
将pGAL-CRE质粒转化至酵母，转化子在SC-His平板上筛选。挑取单菌落接种于SC-His液体培养基并培养至对数中期。随后取1 mL培养物转移至含1 mM雌二醇的SC-His培养基（诱导组）和不含雌二醇的SC-Gal培养基（对照组），于30°C、220 rpm振荡培养8 h。培养后，细胞经梯度稀释并涂布于琼脂平板。30°C培养3天后计数菌落。致死率% = (1 − 诱导组CFU / 对照组CFU) × 100%。
【数据】雌二醇浓度：1 mM；温度：30°C；转速：220 rpm；诱导时间：8 h；菌落计数培养：30°C、3天
2.4 高通量筛选
SCRaMbLE前后的菌株接种于YPD液体培养基并培养至稳定期。收集约10⁷个细胞（1 mL酵母悬液），PBS洗涤两次后重悬。流式细胞分选条件为：波长488 nm，吸收波长520 nm，分选速度6000个/秒。从门控的高荧光群体中随机分离共480个细胞，转移至预装含氯霉素的酵母培养基的96孔板中。
【数据】细胞量：约10⁷个；激发波长：488 nm；吸收波长：520 nm；分选速度：6000/sec；分选细胞数：480个
2.5 基因组测序与分析
挑取单菌落接种于YPD，30°C过夜培养。离心收集细胞，使用酵母基因组DNA提取试剂盒（Solarbio，北京，中国）按厂商方案提取基因组DNA。DNA样品经液氮冷冻后以干冰运输至GENEWIZ（苏州，中国）进行测序。测序读段使用BWA比对至参考基因组，使用SAMtools获取覆盖度与比对结果。使用BreakDancer鉴定大于200 bp的结构变异（SV），包括插入、缺失、倒位和易位。
【数据】培养温度：30°C；SV检测阈值：>200 bp；比对软件：BWA/SAMtools/BreakDancer
2.6 转录组分析
待测序酵母接种于新鲜YPD，培养至对数生长期（约16 h），室温下8000 rpm离心2 min，PBS洗涤两次。去除上清后，细胞沉淀经液氮冷冻，由GENEWIZ公司（中国）进行测序。转录组测序后，使用HISAT2 (v2.2.1)将clean reads比对至参考基因组。使用HTSeq (v0.6.1)计算基因read计数，使用FPKM方法量化基因表达水平。结果以显著性标准过滤（表达变化≥2倍且q值≤0.05的基因），并对显著差异表达基因的上调与下调进行统计分析。
【数据】离心：8000 rpm、2 min、室温；培养时间：约16 h；差异基因阈值：≥2倍变化、q≤0.05
2.7 实时荧光定量PCR
采用qPCR测量工程菌株中基因转录水平。实验按先前描述方法进行（Jia et al., 2018），以酵母cDNA为模板。ACT1基因作为内参进行归一化。
【数据】内参基因：ACT1
2.8 ATP定量
使用ATP检测试剂盒（Solarbio，中国）按说明书测量胞内和胞外ATP水平。样品离心分离上清与细胞沉淀，分别用于测定胞外和胞内ATP。
【数据】试剂盒：ATP Assay Kit (Solarbio, China)
2.9 基因敲除与过表达
基因敲除通过向酵母转化敲除盒实现。该敲除盒由侧翼为同源臂的选择标记（URA3或LEU2）组成，通过同源重组整合至靶位点。对于过表达，先将侧翼为同源臂的URA3标记通过同源重组整合至CAN1或TRP1位点。随后通过反向筛选将靶基因精确整合至相应位点。构建体使用Gibson Assembly组装至PRS413质粒。随后以该质粒为模板PCR扩增用于同源重组的线性DNA片段，转化至酿酒酵母。
【数据】选择标记：URA3/LEU2；整合位点：CAN1/TRP1；载体：PRS413
2.10 蛋白表达与定量
取酿酒酵母冷冻甘油储备液接种于3 mL YPD培养基（30°C，220 rpm，24 h）培养至对数期（OD600 = 2–3）。随后将培养物转移至300 mL新鲜YPD培养基继续发酵（30°C，220 rpm）。72 h后，离心收集细胞（12,000 rpm，10 min，4°C），重悬于10倍体积的结合缓冲液（10 mM Na₂HPO₄、10 mM NaH₂PO₄、20 mM咪唑、500 mM NaCl）。悬液于冰上超声破碎（400 W，开2 s/关4 s）。裂解液经离心澄清（12,000 rpm，20 min，4°C）。所得上清经0.22 μm滤膜过滤，使用ÄKTA pure系统配合Ni-NTA柱纯化。目标蛋白经SDS-PAGE鉴定，使用ImageJ软件量化条带强度。样品中蛋白含量以牛血清白蛋白（BSA）为标准进行测定（Zhu et al., 2025）。细胞生长通过OD600监测，并根据已建立的校准曲线换算为细胞干重（DCW）（1 OD600 = 0.4 mg/mL DCW）。
【数据】培养体积：3 mL→300 mL；温度：30°C；转速：220 rpm；时间：24 h/72 h；离心：12,000 rpm、10 min、4°C；超声：400 W、2 s开/4 s关；缓冲液：10 mM Na₂HPO₄/10 mM NaH₂PO₄/20 mM咪唑/500 mM NaCl；换算：1 OD600 = 0.4 mg/mL DCW
2.11 5 L生物反应器补料分批发酵
挑取单菌落接种于5 mL YPD培养基，30°C、220 rpm振荡培养24 h。所得一级种子培养物转移至300 mL YPD培养基，在相同条件下培养。随后将二级种子培养物接种至初始工作体积为2 L的5 L生物反应器。发酵使用YPD培养基并补充外源氨基酸：赖氨酸、缬氨酸和组氨酸各2 g/L，甘氨酸和天冬氨酸各2.5 g/L。补料分批发酵在30°C、pH 6.0条件下进行。从12 h至120 h，葡萄糖和硫酸铵以6 mL/h的恒定速率连续补料。总发酵时间为120 h。每12 h取样分析。
【数据】初始工作体积：2 L；氨基酸浓度：赖氨酸/缬氨酸/组氨酸各2 g/L，甘氨酸/天冬氨酸各2.5 g/L；温度：30°C；pH：6.0；补料速率：6 mL/h；补料时间：12–120 h；总发酵时间：120 h；取样间隔：12 h
2.12 抗冻性质表征
冰重结晶抑制（IRI）测定、差示扫描量热法（DSC）测试和动态冰晶形态测量均按先前描述的方法进行（Zhang et al., 2023, 2025）。
【数据】原文未详述具体参数
2.13 统计分析
使用Student's t检验确定统计显著性。差异判定标准为：ns（无显著性）、（p < 0.05）、（p < 0.01）、（p < 0.001）。
【数据】统计方法：Student's t检验；显著性阈值：p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001
研究结果
3.1 SCRaMbLE构建LpAFP高产菌株
LpAFP-GFP蛋白通过同源重组整合至合成染色体V的CAN1位点（YEL063C），替换预先插入的URA3标记，生成单倍体菌株zYFW006（图1a）。随后利用SCRaMbLE系统产生多样化的基因型和表型文库。Cre酶活性通过葡萄糖阻遏、半乳糖诱导的AND逻辑门pCRE4（pGal1-Cre-EBD-tCYC1）精确控制，该逻辑门利用Cre-EBD融合蛋白实现严格的操纵控制（图1b）。SCRaMbLE的启动严格依赖于半乳糖和雌二醇的同時存在，触发广泛的基因组重排。由于必需基因的丢失，大多数重排是致死的（Jia et al., 2018）。如图1c所示，仅在含pCRE4的菌株经半乳糖和雌二醇双重诱导后观察到显著的生长受损，证明了AND逻辑门操作的严谨性。此外，倍增时间分析显示仅在双重诱导条件下出现显著增加（12.8 h，比对照高约30%），而单一诱导剂和对照条件无显著影响，表明SCRaMbLE被强烈激活（图1d）。有趣的是，pCRE4 + 乙醇组（不含雌二醇）观察到倍增时间轻微增加（4.7%），这可能归因于少量高表达的Cre-EBD的渗漏核定位（Costanzo et al., 2016; Langdon et al., 2019）。
迭代SCRaMbLE和筛选连续进行四轮，分别产生3.7 × 10⁶、4.0 × 10⁶、7.0 × 10⁶和7.4 × 10⁶株的文库（表S4，见补充材料）。每轮中，约480个候选菌株首先基于荧光强度进行初筛，并在96孔板中用酶标仪进行二次筛选（图S1a，见补充材料）。表现最好的5株在摇瓶发酵中评估，目标蛋白产量最高的菌株被选为下一轮SCRaMbLE的起始菌株（图S1b、图S2，见补充材料）。通过四轮迭代，获得4株高产菌株zYFWI-12、zYFWII-14、zYFWIII-7和zYFWIV-3。与初始菌株相比，这些代表性菌株的蛋白产量呈现不同程度的提高，分别增加了82%、6%、64%和38%（图1e）。然而，由于必需基因的缺失或合成致死遗传互作的发生（Costanzo et al., 2016; Langdon et al., 2019），至第四轮SCRaMbLE时致死率升至97%，因此终止该过程（图1f）。
【数据】文库规模：3.7×10⁶/4.0×10⁶/7.0×10⁶/7.4×10⁶；产量提升：82%/6%/64%/38%；致死率：97%；倍增时间：12.8 h（+30%）；渗漏表达：+4.7%
3.2 基因组测序鉴定候选基因
为鉴定LpAFP产量提高的遗传基础，对亲本菌株zYFW006和4株高产菌株（zYFWI-12、zYFWII-14、zYFWIII-7和zYFWIV-3）进行了基因组测序。比对至染色体synV和synX，发现多个大于200 bp的结构变异，包括4个重复（YJL138C、YEL014C、YER139C、YEL015W）、3个缺失（YEL016C、YEL013W、YEL017W）和3个易位（YEL007W-YEL006W、YER033C-YER034W-YER035W、YJL024C-YJL025W-A-YJL026W）（图2a；表S5，见补充材料）。其中，重点关注受重复或缺失直接影响的7个基因进行进一步验证。
为评估这些基因对LpAFP表达的影响，在亲本菌株中对靶基因进行敲除或过表达，生成菌株zYFW007–zYFW013（图S3，见补充材料）。如图2b所示，NPP2缺失、TIF2过表达和RTR1过表达分别将LpAFP产量提高至139.7、167.5和99.0 mg/L，较对照菌株zYFW006（79.7 mg/L）分别增加75.3%、110.2%和24.2%。进一步的组合验证表明，同时缺失NPP2和过表达TIF2使LpAFP产量达到185.7 mg/L，较zYFW006提高132.9%（图2b）。然而，同时操作全部3个基因并未带来额外益处，可能是由于过度多基因调控造成的代谢负担最终损害了蛋白表达效率（Payne et al., 2008）。
TIF2基因编码翻译起始因子eIF4A RNA解旋酶，通过解开mRNA 5′ UTR的二级结构促进翻译起始复合物的组装，从而提高翻译效率（Meng et al., 2014）。在酿酒酵母中过表达TIF2使总蛋白含量增加26%、总RNA含量增加112%（图2c），表明翻译能力增强的同时伴随转录输出和核糖体组分的上调（Fahy et al., 2005）。此外，RTR1参与磷酸化合物转运和mRNA运输调控——这些过程可能影响重组蛋白表达（Hodko et al., 2016）。有趣的是，VAC8缺失使生物量增加14.8%但未提高LpAFP产量，这与其在自噬相关细胞稳态中的作用一致——主要贡献于细胞生长而非异源蛋白合成（Subramanian et al., 2006）。
值得注意的是，NPP2在提高异源蛋白产量方面的作用此前未见报道。鉴于NPP2编码核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（Byrne and Wolfe, 2005），且酿酒酵母中磷酸代谢与能量稳态紧密偶联，推测NPP2缺失可能扰乱核苷酸和磷酸代谢稳态，从而影响异源蛋白生物合成的能量供给。为探究这一潜在机制，检测了NPP1（与NPP2相关的功能性同工酶）及PHO5（磷酸调控途径的代表性标记基因）的转录水平（Eileen et al., 2005）。如图2d所示，NPP2缺失显著诱导NPP1和PHO5表达上调4.7倍和8.7倍，表明能量动员增强。与此一致，NPP2缺失后36–72 h内胞内ATP水平显著升高（图S4，见补充材料）。综合而言，这些发现表明NPP2缺失可能通过协调调节核苷酸代谢和磷酸动员来增强ATP供给，为异源蛋白生产创造更有利的能量环境，这代表了一种新的代谢工程策略。
【数据】LpAFP产量：NPP2缺失139.7 mg/L（+75.3%）、TIF2过表达167.5 mg/L（+110.2%）、RTR1过表达99.0 mg/L（+24.2%）、对照79.7 mg/L；NPP2缺失+TIF2过表达185.7 mg/L（+132.9%）；总蛋白+26%；总RNA+112%；NPP1上调4.7倍；PHO5上调8.7倍；VAC8缺失生物量+14.8%
3.3 转录组分析鉴定候选基因
为研究LpAFP产量提高背后的转录景观，对亲本菌株和4株突变菌株（zYFWI-12、zYFWII-14、zYFWIII-7和zYFWIV-3）进行了RNA-seq转录组分析。生物学重复间的两两相关系数超过0.8，证实了高重复性和数据可靠性（图3a）。主成分分析进一步显示亲本与突变菌株之间的明显分离，PC1和PC2分别解释总方差的36.9%和31.2%（图S5，见补充材料）。基于这些验证过的数据，鉴定了差异表达基因（DEGs）并进行基于相似性的聚类分析（图S6，见补充材料）。
如图3b所示，4个连续突变体分别表现出85、52、346和575个显著DEGs（包括上调和下调）。值得注意的是，显著DEGs的数量随着连续重排轮次而逐步增加，表明持续的基因组改组逐步放大了转录扰动。KEGG富集分析显示DEGs显著富集于……
【数据】重复相关系数：>0.8；PC1：36.9%方差；PC2：31.2%方差；DEGs数量：85/52/346/575
3.4 基因组与转录组靶点共构建
（原文此部分内容在节选中被截断，仅保留图4与图5对应信息）
图4展示了多靶点组合策略、TIF2在不同启动子下的表达强度以及启动子修饰策略。
图5展示了5 L发酵罐中的发酵结果：（a,b）批式发酵条件下菌株生长与发酵、葡萄糖消耗、乙醇和乙酸积累情况；（c,d）连续补加葡萄糖和氮源过程中的菌株生长与发酵、副产物积累情况。
3.5 LpAFP抗冻性质表征
图6展示了LpAFP的抗冻特性表征：（a）黑麦草抗冻蛋白溶液的冰晶形态，ΔT = −0.05°C；（b）冰晶生长速率统计；（c）不同浓度LpAFP的冰点；（d）退火后PBS和LpAFP（0.15 mg/mL）的光学显微镜图像。
讨论与解读
本研究利用合成生物学方法——SCRaMbLE系统在合成型酿酒酵母中构建突变文库，成功实现了LpAFP的高效生产。多组学分析揭示了13个潜在靶点，其中TIF2和NPP2效果最为显著。TIF2编码关键翻译起始因子，通过增强全局翻译来促进蛋白表达；NPP2编码核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶，其遗传破坏触发NPP1和PHO5的代偿性上调，增加ATP供给以支持蛋白质合成。通过组合代谢工程系统重编程基因表达，减少了不需要的副产物（如乙醇和乙酸）的形成。后续的发酵优化实现了LpAFP的大规模生产，获得了迄今报道的最高产量。这项工作为高产异源蛋白表达和底盘细胞开发建立了整合且有效的框架。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于将SCRaMbLE这一合成染色体工程工具与多组学解析深度耦合——先以进化策略制造多样性，再用组学手段"复盘"出关键靶点TIF2与NPP2，避免了盲目随机突变的黑箱困境。NPP2作为此前未报道过的靶点，其通过调节磷酸代谢与ATP供给影响异源蛋白合成的机制，为真核底盘的能量代谢工程提供了新视角。5 L发酵罐达到1.9 g/L的产量也验证了从实验室到中试规模的可行性。不过，四轮SCRaMbLE后97%的致死率提示该策略的迭代窗口有限；若能将筛选压力与诱导强度进一步优化，或可挖掘更多潜力。
参考来源
Zhang, X. et al. Systematic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient synthesis of Lolium perenne antifreeze protein. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134710
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134710