来源：Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae to enhance resistance toward microbial toxicity in agave extracts（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
龙舌兰兼具高糖含量与耐旱特性，是极具潜力的生物燃料原料，但其天然合成的皂苷类化合物对酿酒酵母具有强烈毒性。本研究采用理性工程与适应性实验室进化（ALE）双轨策略：异源表达尖孢镰刀菌番茄素酶（FoTOM1）使酵母耐受10%龙舌兰提取物；27轮连续传代进化获得可在4%提取物中生长并维持乙醇产量的菌株。全基因组测序揭示多药外排泵与α-葡萄糖苷酶基因突变参与皂苷抗性。两种策略叠加后，工程菌株可在20%提取物中产乙醇，为含毒性组分的生物质原料开发提供了多层级菌株改造范例。
研究背景
龙舌兰原产于美洲炎热干旱地区，商业化种植的年生物量产量可达每公顷干旱土地25,000公斤以上。作为生物炼制原料，龙舌兰乙醇路线的全球变暖影响比玉米低60%，每公顷可生产超7,000升生物乙醇——约为同等面积甘蔗产量的两倍，且不与粮食作物争地。然而，龙舌兰植株为防御病原菌而主动积累的皂苷类糖苷化合物即使在低浓度下也能破坏细胞膜，对酿酒酵母高度致命。这种天然毒性成为龙舌兰生物加工的主要瓶颈。如何在保留菌株发酵性能的前提下解除皂苷毒性，是将龙舌兰推向工业化应用的关键命题。
研究方法
4.1 菌株与培养条件
本工作所用菌株与质粒列于补充表1。以酿酒酵母BY4742（MATα his3Δ leu2Δ lys2Δ ura3Δ）为基础菌株。不含质粒的菌株在YPD培养基（10 g L⁻¹ Bacto酵母提取物、5 g L⁻¹ Bacto蛋白胨、20 g L⁻¹葡萄糖）中培养。除非另有说明，酿酒酵母菌株在14 mL聚丙烯管或250 mL带挡板摇瓶中培养，摇床条件为30°C、300 rpm。厌氧培养在100 mL螺口瓶中进行，装液量40 mL。所有携带营养缺陷标记质粒的酵母菌株使用缺失相应选择氨基酸的合成限定（SD）培养基培养。含FoTOM1表达质粒的酿酒酵母和解脂耶氏酵母菌株在SD-Ura培养基（6.7 g L⁻¹ BD Difco™ Yeast Nitrogen Base without amino acids（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、0.77 g L⁻¹ CSM without uracil（Sunrise Science Products, Knoxville, TN）、20 g L⁻¹ d-葡萄糖）中培养。K. phaffii转化子在SD-His培养基中培养（CSM-Uracil替换为0.77 g CSM-Histidine）。适应性实验室进化使用YPDJ培养基，含10 g L⁻¹ Bacto酵母提取物、5 g L⁻¹ Bacto蛋白胨、20 g L⁻¹葡萄糖及不同浓度龙舌兰提取物。所有质粒构建与扩增在大肠杆菌TOP10中进行。大肠杆菌培养于2 mL Luria-Bertani（LB）肉汤中，添加100 mg L⁻¹氨苄青霉素，37°C、220 rpm、14 mL聚丙烯管培养。
【数据】菌株：S. cerevisiae BY4742（MATα his3Δ leu2Δ lys2Δ ura3Δ）、E. coli TOP10；培养基：YPD（10 g L⁻¹酵母提取物、5 g L⁻¹蛋白胨、20 g L⁻¹葡萄糖）、SD-Ura、YPDJ、LB+100 mg L⁻¹氨苄青霉素；温度：30°C（酵母）、37°C（大肠杆菌）；转速：300 rpm（酵母摇瓶）、220 rpm（大肠杆菌）；时间：原文未详述；厌氧培养：100 mL螺口瓶装液40 mL
4.2 分子克隆与试剂
本研究所用引物与质粒分别列于补充表2和补充表3。克隆试剂与限制性内切酶购自New England Biolabs（NEB, Ipswich, MA）。引物及编码FoTOM1的gBlock DNA片段由Integrated DNA Technologies（IDT, San Diego, CA）合成。野生型FoTOM1序列参照Roldán-Arjona等（1999）报道。本研究使用的FoTOM1完整核苷酸序列见补充表4。采用URA-blaster策略敲除BY4742菌株的PDR5编码序列。两侧带HisG的URA-blaster cassette用EcoRI和BamHI限制性内切酶从Lee和Da Silva（1997）构建的质粒上切下。PDR5上下游各500 bp同源臂以BY4742基因组DNA为模板PCR扩增，基因组DNA使用Zymo Yeastar Genomic DNA Kit（Zymo Research, Irvine, CA）提取。DNA扩增使用Q5® High-Fidelity DNA Polymerase系统（NEB, Ipswich, MA），Gibson组装使用NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix（NEB, Ipswich, MA）。PCR产物与线性化载体经琼脂糖凝胶电泳分离后，用Zymo Research Gel Extraction Kit（Zymo Research, Irvine, CA）纯化。质粒在大肠杆菌TOP10细胞（Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany）中扩增，质粒纯化使用Zymo Research Plasmid Miniprep Kit（Zymo Research, Irvine, CA）。酿酒酵母转化采用基于醋酸锂的电穿孔法，参照Robertson等（2025）描述。解脂耶氏酵母采用基于醋酸锂的化学转化法，参照Chen等（1997）方案。K. phaffii转化使用Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research, Irvine, CA）。
【数据】菌株：E. coli TOP10；工具酶/试剂盒：Q5® High-Fidelity DNA Polymerase、NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix、Zymo Yeastar Genomic DNA Kit、Zymo Research Gel Extraction Kit、Zymo Research Plasmid Miniprep Kit、Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit；同源臂长度：500 bp；限制酶：EcoRI、BamHI；转化方法：醋酸锂电穿孔法（酿酒酵母）、醋酸锂化学法（解脂耶氏酵母）、试剂盒法（K. phaffii）；温度/时间：原文未详述
4.3 龙舌兰汁液提取
龙舌兰汁液提取参照Lu和Wyman（2021）报道方法并作调整。三种龙舌兰全株（Agave americana、Agave salmiana、Agave weberi）从Drylands Farming Company（Ventura, CA）鲜采获得，在加州大学河滨分校实验室处理。处理前先剪去叶片上的尖刺以防操作受伤，随后移除容器。所有土壤和根系结构弃去，仅保留"地上部"生物质用于榨汁。每株植物解剖为两个不同解剖学部分：叶片（pencas）和叶基（piña），后者包括基部叶段及与之相连的中心茎/芯。各物种解剖后的植体部分用去离子水润湿的无绒纸巾（Scotts Multi-fold Paper Towels, Kimberly-Clark, USA）擦净去污，再用E-cloth（E-Cloth Inc., Beverly, MA）擦干。清洁后，叶基与叶片分别称取鲜重，手工切成条状以适配商业4辊甘蔗压榨机（Vevor, Shanghai, China）的窄进料口。所得汁液收集于带刻度的量筒（1 L和5 L）中测定体积。剩余纤维性蔗渣进一步切至约0.5英寸小块，置于定制的3英寸直径金属圆筒中（圆筒带可拆卸底座，底座含25个0.25英寸孔洞并配有压杆），使用12吨液压落地式压机（Eastwood, Pottstown, PA）进行二次压榨，施加约8公吨压力挤出残留在蔗渣中的汁液。压榨后称量蔗渣重量（New Classic SG, Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland）。一次与二次压榨所得汁液合并，磁力搅拌混匀，分装至50 mL聚丙烯管中，3400 rpm离心25分钟（Allegra 25R, Beckman Coulter, Brea, CA），温度15°C，去除粗颗粒。上清液依次经布氏漏斗配1.5-µm滤纸（Whatman 1827-240, Cytiva, Marlborough, MA）过滤，最终经0.22 µm真空驱动无菌膜（Steriflips, Millipore Sigma, St. Louis, MO）过滤。所有提取液样品保存于−20°C备用。
【数据】原料：A. americana、A. salmiana、A. weberi全株；设备：Vevor商业4辊甘蔗压榨机、Eastwood 12吨液压压机；压力：约8公吨；离心：3400 rpm、25 min、15°C；过滤：1.5-µm滤纸+0.22 µm无菌膜；储存：−20°C；提取率：约75%（原文结果部分数据）
4.4 HPLC分析
龙舌兰提取物中游离糖使用高效液相色谱系统（LC-2040c, Shimadzu, Kyoto, Japan）分析，配备Aminex® HPX-87P色谱柱（Bio-Rad, Hercules, CA）和RI检测器（RID-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan）。该色谱柱可实现不同游离糖的高分辨率分离。洗脱液为双去离子水，流速0.6 mL min⁻¹，柱温85°C。保留时间用标准品确定：蔗糖10.15 min；葡萄糖12.14 min；木糖13.11 min；半乳糖13.82 min；阿拉伯糖14.81 min；甘露糖15.66 min；果糖15.85 min。色谱图用LabSolutions软件包（Shimadzu, Kyoto, Japan）积分。各游离糖标准曲线见补充图4。厌氧培养液分析使用Rezex™ ROA-Organic Acid H+（8%）色谱柱（Phenomenex, Torrance, CA），连接RI检测器，流动相为5 mM硫酸，流速0.6 mL min⁻¹，温度60°C。保留时间用标准品确定：葡萄糖10.40 min；乙醇22.00 min。各分析物标准曲线见补充图5。样品制备：取2 mL细胞培养液，5000g离心4分钟，上清液经0.2 µm孔径针头式滤器过滤后进样分析。
【数据】色谱柱：Aminex® HPX-87P（游离糖）、Rezex™ ROA-Organic Acid H+（8%）（有机酸/乙醇）；检测器：RI（RID-20A）；流速：0.6 mL min⁻¹；温度：85°C（糖）、60°C（有机酸）；保留时间：蔗糖10.15 min、葡萄糖12.14 min、木糖13.11 min、半乳糖13.82 min、阿拉伯糖14.81 min、甘露糖15.66 min、果糖15.85 min、乙醇22.00 min；样品制备：2 mL培养液、5000g、4 min、0.2 µm过滤
4.5 皂苷分析
皂苷分析前为除去游离糖，取1 mL来自A. americana、A. salmiana和A. weberi叶片和叶基组织的提取液，使用Strata-X聚合物反相固相萃取（SPE）小柱（33 µm；Phenomenex, Torrance, CA）处理。小柱安装于真空歧管上，先用1 mL甲醇活化，再用1 mL水平衡。龙舌兰提取液上样后，用1 mL 5%甲醇洗涤。代谢物（原文节选在此截断，后续步骤原文未详述）。
【数据】样品量：1 mL；SPE柱：Strata-X聚合物反相小柱（33 µm）；活化：1 mL甲醇；平衡：1 mL水；洗涤：1 mL 5%甲醇；其余参数：原文未详述
研究结果
2.1 龙舌兰叶片提取物的组成分析
A. salmiana、A. weberi和A. americana是具有生物加工原料应用潜力的植物。为验证这一点，研究首先制备富含糖的叶片提取物。从成熟植株上取下完整叶片，将宽扁的叶片部分（leaf blade）与叶基（leaf base）分离（图1a）。使用商业榨汁机处理各叶片部分并挤压已加工生物质获得液体提取物（补充图1）。提取过程所得汁液质量约占叶片总质量的75%。
随后研究表征了各物种叶片与叶基的糖含量，通过HPLC定量葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、蔗糖和木糖。在所有物种和叶片类型中，A. weberi的总游离糖含量最高（约26 g L⁻¹），叶片和叶基提取物均如此（图1b）。果糖是最丰富的糖，占叶基提取物总游离糖含量的59–75%，占叶片提取物的48–53%。葡萄糖含量位居第二，其余糖含量均低于5%。所有提取物均呈微酸性，pH约5.2或更低（补充表5）。
为评估龙舌兰提取物的毒性并建立改良基线，研究在丰富培养基中配制1%至50%浓度的叶片提取物，对酿酒酵母BY4742进行生长测定。叶片提取物被证明毒性极强（图1c）：BY4742在1% A. weberi提取物上仅有微弱生长，在1% A. salmiana和A. americana提取物上完全不生长。叶基提取物的毒性显著较低，BY4742可耐受高达50%的A. salmiana叶基提取物、10%的A. weberi叶基提取物和1%的A. americana叶基提取物。商业产乙醇菌株EthanolRed的结果与BY4742相似（补充图2）。A. americana表现出的较高毒性与该物种叶基中皂苷浓度高于其他物种相关（图1c）。高皂苷浓度也与叶片提取物的高毒性相关——叶片提取物中总皂苷含量比叶基高2–6倍。
在所有样品中，UHPLC-MS/MS分析鉴定出40种独特的甾体皂苷（图2a；补充数据文件2），揭示出组织间和物种间在定性组成与相对丰度上的显著差异。尽管每种龙舌兰都呈现特征性皂苷谱，但叶基与叶片组织之间存在清晰且一致的差异。叶基富集较低分子量皂苷，主要为分子式C50H80O24和C50H78O24的物种。两种最丰富的叶基富集化合物被初步鉴定为带三个己糖和一个戊糖修饰的manogenin衍生物（manogenin + Hex-Pent-Hex-Hex；C50H80O24）和带相同糖组成的9-dehydromanogenin（C50H78O24）。相比之下，叶片组织向含额外戊糖残基的更高分子量皂苷偏移，包括C55H86O27和C55H88O27，与hecogenin或9-dehydrohecogenin苷元连接三个己糖和两个戊糖的结构一致。值得注意的是，一种C55H86O28物种（manogenin带两个戊糖和三个己糖）在A. americana和A. weberi的叶基中积累，但在A. salmiana中基本缺失。更高分子量的化合物如C61H96O31和C61H98O31（对应hecogenin和9-dehydrohecogenin衍生物带两个戊糖、三个己糖及额外一个脱氧己糖）在A. americana和A. weberi的叶片组织中含量突出，但在A. salmiana中显著减少。
主成分分析进一步解析了这些组成模式，PC1（40.1%）和PC2（22.2%）合计解释62.3%的总方差（图2b）。样品主要沿PC1按组织类型分离，表明叶基和叶片代表不同的化学型。在每个组织类别内，物种特异性聚类明显，凸显遗传背景对皂苷结构的贡献。A. salmiana的叶片提取物形成尤为独特的聚类，特征是总皂苷丰度最高但最高分子量、高度糖基化物种的占比低于其他分类群（图2a）。研究注意到A. salmiana提取物的毒性高于A. weberi或A. americana的提取物。
基于精确质量数、碎裂行为和UV吸光度谱，研究将最丰富皂苷的苷元初步鉴定为hecogenin、9-dehydrohecogenin、manogenin和9-dehydromanogenin（补充数据文件2）。若干主要化合物表现出指示共轭双键的特征性UV吸收，与9-dehydrohecogenin和9-dehydromanogenin一致（补充图3）。相比之下，饱和对应物hecogenin和manogenin缺乏共轭体系，因此UV吸收极弱。这些鉴定与先前报道的龙舌兰甾体皂苷化学一致，并证实观察到的组成差异不仅限于总皂苷丰度，还包括苷元氧化状态和糖基化结构的系统性变化（Sidana et al., 2016）。
重要的是，A. salmiana叶片提取物的独特聚类可能不仅反映皂苷浓度升高，还反映分子结构上的质性差异。与其他物种相比，A. salmiana似乎富集含较少糖单元和相对较少羟基化苷元的皂苷，特别是中等糖基化状态的hecogenin和9-dehydrohecogenin衍生物（补充数据文件1）。糖基化程度和苷元羟基化均已知是抗真菌活性的决定因素：中等糖单元数优化两亲性平衡和膜插入能力，而过度糖基化或额外极性取代基可降低皂苷分配进入富含甾醇的真菌膜的能力（Yang et al., 2006）。同样，苷元羟基化程度增加（尤其是C2位）会降低疏水性，可能削弱膜结合（Vo et al., 2017）。因此，A. salmiana叶片提取物表现出的显著抗真菌活性可能反映了一种结构优化的皂苷谱——将有利的苷元化学与最佳糖残基数结合，而非单纯依赖更高的总皂苷水平。综上，这些结果表明龙舌兰皂苷组成沿解剖学和组织学两个轴线结构化分布，糖基化与苷元结构的细微变化产生具有潜在重要功能后果的独特化学型。
【数据】总游离糖：A. weberi约26 g L⁻¹（最高）；果糖占比：叶基59–75%、叶片48–53%；其他糖：<5%；pH：约5.2或更低；毒性耐受：BY4742可耐受50% A. salmiana叶基、10% A. weberi叶基、1% A. americana叶基提取物；叶片提取物中皂苷含量比叶基高2–6倍；鉴定皂苷数：40种；PC1=40.1%、PC2=22.2%，合计62.3%；叶片提取物质量约占叶片总质量75%
2.2 番茄素酶表达增强龙舌兰提取物耐受性
提高酿酒酵母在龙舌兰提取物中生长能力的第一项策略是原位处理皂苷。为此，研究过表达了来自尖孢镰刀菌番茄专化型（Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici）的番茄素酶FoTOM1。该基因编码一种糖苷酶，可切割α-番茄素中糖基与苷元之间的糖苷键，从而降低毒性（Bouarab et al., 2002）。此前报道该策略使酿酒酵母对α-番茄素的抗性达到约200 mg L⁻¹（Cira et al., 2008），研究假设该策略可推广至龙舌兰提取物中的各类皂苷。
从高拷贝附加体质粒表达FoTOM1验证了这一假设——携带表达FoTOM1的2µ质粒的酿酒酵母能够在含高达10% A. americana和A. weberi提取物的培养基上生长（图3a、b）。总皂苷浓度最高的A. salmiana叶片提取物毒性更强，将生长限制在仅2.5%提取物浓度。
【数据】FoTOM1来源：Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici；α-番茄素抗性：约200 mg L⁻¹（文献报道值）；生长耐受：10% A. americana、10% A. weberi提取物；A. salmiana叶片提取物仅支持2.5%浓度下生长
2.3 适应性实验室进化提高龙舌兰提取物耐受性
（原文节选在此处截断，以下内容基于摘要与结论中的相关信息进行编译）
在平行策略中，研究采用适应性实验室进化（ALE）提高菌株耐受性。通过27轮连续传代培养，使菌株逐步适应递增浓度的龙舌兰提取物。进化后的菌株能够在4%龙舌兰提取物中生长，且乙醇产量与起始菌株相当。
全基因组测序揭示了多药外排泵基因（PDR5和PDR1）编码序列中的突变，以及α-葡萄糖苷酶基因（IMA3）邻近非编码序列的突变，提示这些基因在皂苷抗性中发挥作用。
【数据】ALE传代数：27轮；进化菌株耐受浓度：4%提取物；突变基因：PDR5、PDR1（编码序列）、IMA3（非编码相邻序列）
2.4 组合策略的协同效应
将两种策略——FoTOM1过表达与进化菌株——相结合，产生了协同效应。组合工程菌株能够在20%龙舌兰提取物中发酵生产乙醇，显著高于单一策略的耐受水平（10%与4%）。
【数据】组合菌株乙醇生产耐受浓度：20%提取物；单一策略耐受水平：FoTOM1表达10%、ALE进化4%
讨论与解读
龙舌兰高糖含量与耐旱特性使其成为极具前景的生物质原料，但高皂苷含量对酿酒酵母的毒性构成主要障碍。其他酵母如代谢工程宿主马克斯克鲁维酵母已知可耐受皂苷，提示设计能克服皂苷敏感性的酿酒酵母菌株是可行的。本研究采用双管齐下的策略：一是通过异源表达FoTOM1引入皂苷降解特性——其酶产物切割皂苷糖基与苷元之间的连接，降低毒性——这种原位防御策略使酿酒酵母能够在含10% A. americana提取物的培养基中生长；二是通过ALE增加抗性，分离出带有外排转运和应激反应基因修饰的菌株，将龙舌兰提取物耐受性提升至4%，并同样提高了商业产乙醇菌株Ethanol Red的耐受性。两种策略组合后产生协同效应，获得的工程酿酒酵母菌株可在20%龙舌兰提取物中发酵生产乙醇。
编译者解读：本研究展示了一条值得借鉴的双轨抗逆工程路线——"解毒酶异源表达+全基因组适应性进化"的组合拳。FoTOM1的底物谱宽窄值得关注：它能降解α-番茄素及部分龙舌兰皂苷，但对A. salmiana中结构特化的皂苷效果有限，这提示酶工程改造需进一步拓展底物范围。ALE策略的优势在于无需预设靶点即可捕获PDR5、IMA3等多基因协同突变，但进化菌株仅耐受4%提取物——单一突变积累的收益存在上限。真正亮点在于两策略的叠加效应远超简单加和（4%+10%→20%），暗示解毒与泵出机制之间存在协同窗口。从工业视角看，20%提取物浓度已接近可操作的发酵底物水平，但皂苷组成随物种和组织差异巨大，菌株-原料匹配将是实际应用的关键变量。全基因组测序发现的非编码区突变也为后续精细调控IMA3表达提供了新靶点。
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134891