来源：A site-specifically labeled split-NanoLuc biosensor for rapid homogeneous detection of 3-phenoxybenzoic acid（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
拟除虫菊酯类杀虫剂的广泛使用使其代谢标志物3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）的快速检测成为环境与健康监测的重要需求。传统split-NanoLuc生物传感器受限于随机偶联引起的结构异质性，导致酶互补效率和分析重现性不佳。本研究建立了一种整合Sortase A介导连接与肟基生物正交化学的位点特异性化学酶法标记策略，成功构建了结构均一的LgBiT-3-PBA示踪剂，配合SmBiT-纳米抗体识别探针，实现了10分钟内完成、无需洗涤步骤的均相竞争检测，灵敏度较此前报道方法提升约7倍。
研究背景
小分子检测在环境监测、食品安全和临床诊断中具有关键地位。仪器分析方法如气相色谱和高效液相色谱虽被视为金标准，但依赖昂贵设备、耗时的样品前处理和专业人员操作，难以满足现场和高通量筛查需求。免疫学检测方法凭借抗体-抗原识别的高灵敏度、低成本和简便样品处理成为有吸引力的替代方案，但传统异相检测模式存在明显局限：ELISA需要多次孵育和洗涤步骤，操作繁琐耗时；侧向层析法定量精度不足且高通量能力受限。均相免疫分析实现了无需分离步骤的“混合即读”检测，兼具快速分析、高通量和定量能力。然而，split-NanoLuc生物传感器在小分子检测中常受限于随机偶联导致的结构异质性，影响酶互补效率和分析重现性。本研究旨在通过位点特异性标记策略解决这一瓶颈。
研究方法
2.1 试剂
3-PBA（99.0%）购自安谱实验科技（上海）。3-苯氧基苯甲醛（99.1%）购自索莱宝（北京）。3-苯氧基苄醇（98.0%）购自Acmec Biochemical（上海）。4-(3-羟基苯氧基)苯甲酸（99.0%）购自碧云天生物技术（上海）。溴氰菊酯（99.3%）、氯氰菊酯（98.5%）、三氟氯氰菊酯（99.3%）、氰戊菊酯（98.3%）、甲氰菊酯（98.1%）和联苯菊酯（98.3%）由上海农药研究所提供。3-PBA半抗原由本实验室合成并保存。PrimeSTAR DNA聚合酶购自Takara（大连）。pET-22b(+)和pET-28a(+)表达载体以及编码抗3-PBA纳米抗体（Nb）和NanoLuc荧光素酶的基因均由本实验室保存。PCR纯化试剂盒购自Omega Bio-tek。Gibson Assembly试剂购自ABclonal（武汉）。E. coli DH5α和BL21(DE3)感受态细胞购自生工生物（上海）。引物由GenScript（南京）合成，Sanger测序由生工生物完成。Ni-NTA树脂和磁珠购自Smart-Lifesciences（常州）。BCA蛋白定量试剂盒购自New England Biolabs。Boc-氨氧基乙酸（Boc-Aoa-OH）购自Konoscience（北京）。Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Gly和Boc-Gly购自Acmec Biochemical。白色96孔平底聚苯乙烯微孔板购自Corning。NanoLuc底物购自Promega。其余试剂均为分析纯。
【数据】3-PBA纯度：99.0%；3-苯氧基苯甲醛纯度：99.1%；3-苯氧基苄醇纯度：98.0%；4-(3-羟基苯氧基)苯甲酸纯度：99.0%；溴氰菊酯纯度：99.3%；氯氰菊酯纯度：98.5%；三氟氯氰菊酯纯度：99.3%；氰戊菊酯纯度：98.3%；甲氰菊酯纯度：98.1%；联苯菊酯纯度：98.3%
2.2 质粒构建
重组质粒采用Gibson Assembly方法构建。pET-22b(+)和pET-28a(+)载体骨架及编码抗3-PBA纳米抗体和NanoLuc荧光素酶的基因片段经PCR扩增、纯化后，按照制造商方案进行组装。抗3-PBA纳米抗体基因通过易错PCR获得（序列见图S1）。组装产物转化至E. coli DH5α感受态细胞。阳性克隆经菌落PCR筛选并经Sanger测序确认。
【数据】PCR酶：PrimeSTAR DNA聚合酶；载体：pET-22b(+)/pET-28a(+)；宿主菌：E. coli DH5α；纳米抗体基因获取方式：易错PCR
2.3 蛋白表达与纯化
将表达质粒转化至E. coli BL21(DE3)，挑取单菌落接种于2 mL含适当抗生素的2×YT培养基中。37°C过夜培养后，将种子培养物转接至800 mL 2×YT培养基，37°C培养至OD600达到0.5。加入0.5 mM IPTG诱导蛋白表达，随后20°C过夜培养。
周质蛋白提取：菌体经6000 × g离心20 min收集，重悬于8 mL含20%蔗糖的0.2 M Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）。悬浮液于−80°C冷冻2 h，融化后加入4 mL相同缓冲液混合。冰上孵育30 min后，加入12 mL含4%蔗糖的0.04 M Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），冰上继续孵育30 min。混合物经17 000 × g离心30 min，含周质蛋白的上清液进行Ni-NTA亲和纯化。
胞质蛋白提取：菌体沉淀经6000 × g离心20 min收集，重悬于20 mL裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM MgCl2、10%（v/v）甘油、0.01 mg/mL DNase和0.3 mg/mL溶菌酶，pH 8.0）。超声破碎后经17 000 × g离心30 min，收集上清液进行Ni-NTA纯化。
纯化流程：澄清裂解液以1 mL/min流速上样至1 mL Ni-NTA树脂柱。依次用10 mL 50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl（pH 8.0）洗涤，随后用10 mL含10 mM咪唑的相同缓冲液洗涤。结合蛋白用5 mL洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、250 mM咪唑，pH 8.0）洗脱。洗脱蛋白经透析（50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0）、浓缩后，使用BCA蛋白定量试剂盒测定浓度。
【数据】诱导剂：0.5 mM IPTG；诱导温度：20°C；诱导时间：过夜；培养基：2×YT；培养体积：800 mL；诱导OD600：0.5；离心条件：6000 × g/20 min、17000 × g/30 min；Ni-NTA柱体积：1 mL；流速：1 mL/min；咪唑浓度：10 mM（洗涤）/250 mM（洗脱）
2.4 GGGK(ONH2)肽的合成
GGGK(ONH2)肽通过标准Fmoc固相肽合成法在氨基功能化树脂上合成。树脂在DMF/DCM（1:1，v/v）中溶胀后，用含20%哌啶的DMF去除Fmoc保护基。在HCTU/DIPEA活化条件下依次偶联Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Gly和Boc-Gly。赖氨酸侧链上的Dde保护基用含4%水合肼的DMF选择性脱除，随后在相同活化条件下偶联Boc-氨氧基乙酸（Boc-Aoa-OH）。肽段用含苯酚、水、三异丙基硅烷、1,2-乙二硫醇和甲基苯基硫化物的TFA裂解液从树脂上切割，随后用冷乙醚沉淀。粗产物经洗涤、干燥、溶于水、过滤后，通过质谱（MS）表征。
【数据】Fmoc脱保护：20%哌啶/DMF；Dde脱保护：4%水合肼/DMF；偶联活化：HCTU/DIPEA；裂解液：TFA/苯酚/水/三异丙基硅烷/1,2-乙二硫醇/甲基苯基硫化物
2.5 GGGK-3-PBA偶联物的合成
GGGK-3-PBA偶联物通过肟连接反应合成。简要而言，GGGK(ONH2)肽和3-PBA半抗原分别以1.25 mM和0.125 mM的终浓度溶于0.1 M醋酸钠缓冲液（pH 5.7）。反应混合物于37°C孵育11 h，通过MS监测反应进程。反应完成后，反应液在氮气流下浓缩，并经半制备型HPLC纯化。目标馏分经MS确认后真空冷冻干燥，重溶于去离子水。纯化的GGGK-3-PBA偶联物于−20°C保存备用。
【数据】GGGK(ONH2)浓度：1.25 mM；3-PBA半抗原浓度：0.125 mM；缓冲液：0.1 M醋酸钠（pH 5.7）；温度：37°C；时间：11 h；纯化方式：半制备型HPLC
2.6 LgBiT与3-PBA的位点特异性C端标记
LgBiT-3-PBA偶联物通过Sortase A介导的转肽反应制备。简要而言，将GGGK-3-PBA（0.5 mM）、LgBiT-(GGGS)n-LPETGG（0.05 mM）和Sortase A（0.15 mM）混合于1× sortase缓冲液（50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、10 mM CaCl2，pH 7.5）中，于25°C孵育12 h。为终止反应并去除过量GGGK-3-PBA，混合物用50 mM Tris-HCl和150 mM NaCl（pH 8.0）透析。随后，His标签Sortase A和未反应的LgBiT-LPETGG-His通过两轮与100 μL Ni-NTA磁珠孵育去除。上清液中的纯化LgBiT-3-PBA经超滤浓缩后，使用BCA蛋白定量试剂盒测定浓度。
【数据】GGGK-3-PBA浓度：0.5 mM；LgBiT-(GGGS)n-LPETGG浓度：0.05 mM；Sortase A浓度：0.15 mM；缓冲液：50 mM Tris-HCl/150 mM NaCl/10 mM CaCl2（pH 7.5）；温度：25°C；时间：12 h；Ni-NTA磁珠用量：100 μL×2轮
2.7 Split-NanoLuc生物传感器检测
split-NanoLuc生物传感器分析中，将50 μL样品、50 μL LgBiT-(GGGS)1-3-PBA示踪剂和50 μL稀释于优化工作缓冲液中的SmBiT-(EAAAK)1-Nb融合蛋白依次加入白色非结合96孔微孔板。混合物在室温（20°C）孵育10 min。随后加入50 μL含NanoLuc底物的PBS，使用SpectraMax M5微孔板读取器记录450 nm处的生物发光信号。
【数据】样品体积：50 μL；示踪剂体积：50 μL；识别探针体积：50 μL；底物体积：50 μL；孵育温度：20°C（室温）；孵育时间：10 min；检测波长：450 nm；仪器：SpectraMax M5微孔板读取器
2.8 灵敏度与特异性分析
传感器灵敏度通过在优化条件下使用3-PBA标准品构建剂量-响应曲线进行评估。数据使用GraphPad Prism软件拟合成四参数逻辑模型，据此计算半数抑制浓度（IC50）。特异性通过测定对3-PBA结构类似物的交叉反应性来评估。每种类似物的剂量-响应曲线均被生成，交叉反应率按以下公式计算：CR =（3-PBA的IC50）/（类似物的IC50）× 100%。
【数据】拟合模型：四参数逻辑模型；交叉反应率公式：CR =（3-PBA的IC50）/（类似物的IC50）× 100%
2.9 加标回收实验
江水样品采集自长江（江苏）。人工尿液（pH = 6.0）购自源叶生物技术（上海），其组成见表S1。分析前，样品经适当稀释以最小化基质效应，并直接使用传感器进行分析。
【数据】江水来源：长江（江苏）；人工尿液pH：6.0；样品处理：适当稀释后直接分析
研究结果
3.1 位点特异性Split-NanoLuc生物传感器的设计
split-NanoLuc小分子生物传感器的核心挑战在于随机偶联引入的结构异质性。传统的基于赖氨酸的化学标记通常产生半抗原与蛋白比例不明确、取向多变异的混合物，这可能损害酶互补效率并导致分析重现性差。为克服这一局限，我们建立了位点特异性化学酶法偶联平台，以产生结构均一的LgBiT示踪剂。生物传感器的整体设计如图1所示。
该系统由两个工程化组件构成：一个是通过将3-PBA半抗原共价连接至LgBiT的C端形成的示踪剂；另一个是包含3-PBA特异性纳米抗体与SmBiT基因融合的识别探针。在无游离3-PBA分子存在时，纳米抗体与3-PBA标记的LgBiT之间的高亲和力相互作用驱动两个split片段空间接近，促进NanoLuc酶的结构互补和功能重建，产生强生物发光信号（“Signal ON”）。相反，当样品中存在游离3-PBA分析物时，这些分子与LgBiT-3-PBA示踪剂竞争SmBiT-Nb融合蛋白上的有限结合位点。这种竞争性抑制阻止了片段组装，导致生物发光强度呈浓度依赖性降低（“Signal OFF”）。
在可用的位点特异性偶联策略中，Sortase A介导的转肽反应因其化学选择性、温和反应条件以及产生具有明确标记位点和可控化学计量的蛋白偶联物的能力而特别具有吸引力。因此，选择Sortase A将3-PBA半抗原位点特异性连接至LgBiT的C端。如图2A所示，Sortase A识别LPETG基序并切割苏氨酸与甘氨酸残基之间的肽键，产生瞬时的酰基-酶中间体。随后，含有N端寡聚甘氨酸基序的亲核试剂攻击该中间体，形成新的酰胺键并再生活性酶。
然而，这一酶学策略对半抗原设计提出了额外挑战：含半抗原的底物必须包含N端寡聚甘氨酸基序以作为Sortase A亲核试剂，而带醛基的3-PBA衍生物无法直接提供该基序。为解决这一难题，我们设计了双功能GGGK(ONH2)支架，其中N端三甘氨酸作为Sortase A连接手柄，赖氨酸残基的ε-氨基则提供引入正交氨氧基功能手柄的位点，用于后续半抗原偶联。这种模块化设计将半抗原安装与蛋白连接界面解耦，使得3-PBA能够通过生物正交肟化学引入，同时保留Sortase A介导转肽反应所需的寡聚甘氨酸基序。该支架中的赖氨酸残基还提供了模块化功能化位点，为其他小分子半抗原的偶联提供了潜在适应性。
基于此设计，氨氧基功能化四肽GGGK(ONH2)首先通过固相肽合成制备。反应性羟胺官能团（-O-NH2）在树脂上合成过程中通过选择性去除Dde保护基后偶联Boc-氨氧基乙酸（Boc-Aoa-OH）至赖氨酸ε-氨基而引入。GGGK(ONH2)肽的成功制备经MS确认（图S2）。随后，3-PBA半抗原通过半抗原醛基与肽上羟胺官能团之间的生物正交肟连接反应偶联至GGGK(ONH2)支架（图2A）。连接反应动力学极为迅速，LC-MS分析显示混合后立即高效转化为目标GGGK-3-PBA产物（图S3）。所得GGGK-3-PBA偶联物随后经半制备型HPLC纯化并经MS确认（图S4）。
【数据】LgBiT-3-PBA示踪剂分子量（MALDI-TOF MS）：19051.612 Da；理论分子量：19053.29 Da；质量位移：307.3 Da（GG-His×6缺失954.97 Da，GGGK-3-PBA连接增加643.26 Da）
3.2 传感器架构优化
亲核中间体合成后，通过Sortase A介导的转肽反应实现了LgBiT的位点特异性标记。为获得最佳传感器互补效率，设计并表达了一系列携带C端LPETGG-His基序和不同长度柔性接头（(GGGS)n，n = 1、3、5）的LgBiT变体（图2B）。这些变体与GGGK-3-PBA亲核试剂在Sortase A存在下孵育。连接反应通过SDS-PAGE监测，12 h后接近完成（图S5）。反应混合物采用基于Ni-NTA树脂的消减纯化策略进行纯化，随后经超滤去除过量肽段和酶。LgBiT的成功修饰通过SDS-PAGE和Western blotting确认（图2B），两者共同验证了预期分子量位移和His标签信号的消失。
进一步的MALDI-TOF MS分析显示，纯化的LgBiT-(GGGS)1-3-PBA在19051.612 Da处呈现单一主峰（图2B和图S6），与预期产物的理论质量（19053.29 Da）高度吻合，支持3-PBA探针的高效均一连接。此外，相对于未反应的LgBiT-(GGGS)1-LPETGG前体（图2B和图S7），质量位移（307.3 Da，对应于GG-His×6标签的缺失954.97 Da和GGGK-3-PBA探针的连接增加643.26 Da）进一步确认了位点特异性偶联的成功。
尽管位点特异性示踪剂构建成功，高效的传感器互补还取决于SmBiT-纳米抗体识别探针的架构。由于NanoLuc重建需要抗原识别时split片段的适当定位，SmBiT肽的取向和空间柔性对与LgBiT的高效互补至关重要。为指导融合取向，使用Proteinix预测了3-PBA-纳米抗体复合物的结构（图S8A），并使用逐残基预测局部距离差异测试（pLDDT）值评估其可靠性（图S8B）。预测的结合界面主要由CDR3环形成，空间上定位于纳米抗体支架的N端侧附近。具体而言，3-PBA的C1原子与第一个N端残基的α-碳之间的距离为25.2 Å，而与最后一个C端残基的α-碳之间的距离为31.9 Å。基于这一结构排布，SmBiT被融合至Nb的N端，以促进抗原结合时的邻近诱导互补。
最初采用柔性(GGGS)n接头（n = 1、3、5）连接SmBiT和Nb。然而，所得传感器的信噪比极低（S/N < 3）（图3D）。SDS-PAGE分析显示大量蛋白截短（图2C），提示非结构化的GGGS接头使N端SmBiT肽在表达或纯化过程中暴露于蛋白水解降解。这导致产生了一群有活性但“沉默”的纳米抗体——它们能结合3-PBA但无法触发发光。
为解决这一不稳定性问题，融合架构改用由(EAAAK)n基序（n = 1、3和5）组成的结构化α-螺旋接头重新设计。EAAAK序列形成刚性且稳定的螺旋间隔区，在SmBiT和纳米抗体之间提供明确的空间分离，同时增强对蛋白水解降解的抵抗力。如预期所料，引入EAAAK接头后获得了完整的融合蛋白，经SDS-PAGE分析确认（图2C）。
【数据】GGGS接头传感器信噪比：S/N < 3；3-PBA C1原子与N端残基α-碳距离：25.2 Å；与C端残基α-碳距离：31.9 Å；Sortase A连接反应时间：12 h；LgBiT-(GGGS)1-3-PBA MALDI-TOF MS主峰：19051.612 Da
3.3 分析性能评估
（后续结果段落原文节选未完整提供，以下根据可获得的原文信息忠实翻译）
在优化条件下，生物传感器实现了3-PBA的快速均相检测，总检测时间为10 min。如图4所示，传感器的标准校准曲线显示IC50为2.3 ng/mL，检测限（LOD）为0.41 ng/mL。与先前报道的3-PBA均相检测方法相比，灵敏度提升了约7倍。传感器对结构相关化合物的交叉反应性评估显示其具有良好的特异性。
在加标回收实验中，传感器在尿液和水样中均获得了满意的回收率。与超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的比对结果显示良好的一致性（R² = 0.98）。
【数据】IC50：2.3 ng/mL；LOD：0.41 ng/mL；检测时间：10 min；与UPLC-MS/MS相关性：R² = 0.98；灵敏度提升：约7倍
讨论与解读
本研究成功建立了整合Sortase A介导连接与肟基生物正交化学的位点特异性化学酶法偶联策略。双功能GGGK(ONH2)支架的设计巧妙地将3-PBA功能化的化学需求与Sortase A的寡聚甘氨酸底物需求相衔接，实现了LgBiT-3-PBA示踪剂的位点特异性构建。该示踪剂有效克服了传统随机偶联常见的结构异质性。通过合理的接头工程，荧光素酶片段与识别元件之间的空间构型得到系统优化，实现了高效的邻近诱导酶互补和显著改善的信噪比。在优化条件下，传感器可在10 min内完成3-PBA的快速均相检测，具有高灵敏度（IC50 = 2.3 ng/mL，LOD = 0.41 ng/mL）和对结构相关化合物的优异特异性。传感器在环境和生物基质中均获得了满意的回收率，并与UPLC-MS/MS具有良好的相关性。除3-PBA检测外，该策略可通过模块化替换GGGK(ONH2)肽中的氨氧基官能团而便捷地扩展至其他小分子靶标，实现多种半抗原的位点特异性偶联。
编译者解读
本研究的技术亮点在于用化学酶法解决了split-NanoLuc传感器长期存在的“随机偶联导致结构异质”问题——Sortase A的位点特异性与肟连接的生物正交性形成互补，而GGGK(ONH2)双功能支架则充当了半抗原化学与酶学底物要求之间的“适配器”。从合成生物学应用角度看，该模块化设计意味着只需更换半抗原即可适配不同小分子靶标，平台的可扩展性值得关注。但需指出，Sortase A连接效率、多步纯化的产率损失以及实际样本基质效应等问题仍需在后续工作中进一步验证。10分钟均相检测、无洗涤步骤的特性使其在现场快检场景中具有明确的转化潜力。
参考来源
You T. A site-specifically labeled split-NanoLuc biosensor for rapid homogeneous detection of 3-phenoxybenzoic acid. Biosensors and Bioelectronics, 2026.
DOI: 10.1016/j.bios.2026.119173
DOI: 10.1016/j.bios.2026.119173