基于Zr-MOF电化学生物传感器检测蛋白激酶A活性

来源：Zr-MOF based electrochemical biosensor coupled with [Ru(NH3)6]3+ mediated signal amplification for detection of protein kinase A（Bioelectrochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

蛋白激酶A（PKA）是调控细胞功能的关键信号酶，其活性异常与多种疾病密切相关。本文报道了一种基于锆基金属有机框架（Zr-MOF）和[Ru(NH₃)₆]³⁺信号放大的无标记电化学生物传感器，通过Zr-O-P键实现磷酸化肽段的特异性固定，在0.05–100 U mL⁻¹范围内实现对PKA活性的定量检测，检出限达0.016 U mL⁻¹，并成功应用于抑制剂筛选和细胞裂解液检测。

研究背景

PKA介导的磷酸化是调控转录、代谢、胞内信号转导及凋亡等多种细胞功能的基础过程。PKA活性失调与糖尿病、心血管疾病、阿尔茨海默病及癌症等重大疾病密切相关，使其成为重要的诊断生物标志物和治疗靶点。现有PKA检测方法多依赖放射性标记、电活性标记或ATP类似物的生物素化/硫醇化修饰，结合抗体、蛋白及含金属离子材料等识别元件。其中，基于金属离子功能化材料的检测策略因其独特的磷酸化识别能力而备受关注。发展灵敏可靠的PKA活性定量及抑制剂筛选方法，对临床诊断和药物发现具有重要意义。

研究方法

2.1 DNA-Au NPs-肽复合物的制备

新购DNA使用前需预处理。首先，DNA在10000 rpm下离心5 min，防止管壁上残留DNA粉末。随后用超纯水将DNA稀释至200 μM，分装后于−20 °C冰箱保存。在与肽和Au NPs结合前，DNA用新鲜配制的15 mM TCEP在避光条件下处理1 h，以还原DNA硫醇端的二硫键。随后用DNA稀释缓冲液（20 mM Tris-HCl，20 mM NaCl，pH 8.0）稀释至实验所需浓度，95 °C加热5 min后立即置于冰水浴中快速冷却，使DNA形成直链结构。处理后的DNA溶液可于4 °C冰箱保存。

肽用肽固定缓冲液（20 mM Tris-HCl，50 mM KCl，10 mM MgCl₂，1 mM TCEP，pH 7.4）稀释至所需浓度，于−20 °C冰箱保存。

DNA-Au NPs-肽复合物的制备方法如下：将DNA（8 μM，100 μL）、肽（4 μM，100 μL）和Au NPs（8 nM，100 μL）混合，室温孵育过夜。随后采用盐老化法提高DNA链的负载效率——向DNA-Au NPs-肽溶液中分次加入共60 μL NaCl溶液（1 M），每次加10 μL，间隔1 h，最终NaCl浓度调至0.167 M。每次添加后超声处理1 min以确保均一性。所有操作均在避光条件下进行。

混合物随后在室温下继续孵育24 h，然后加入20 μg mL⁻¹ BSA（20 μL）封闭Au NPs表面的非特异性结合位点。1 h后，DNA-Au NPs-肽溶液离心三次（15,000 rpm，30 min），以去除未结合的DNA和肽残留。纯化后的DNA-Au NPs-肽复合物重悬于DNA稀释缓冲液中，4 °C避光保存备用。

【数据】离心转速：10000 rpm（DNA预处理）/15000 rpm（纯化）；DNA浓度：200 μM（储存）/8 μM（反应）；TCEP浓度：15 mM；肽浓度：4 μM；Au NPs浓度：8 nM；NaCl终浓度：0.167 M；BSA浓度：20 μg mL⁻¹；温度：95 °C（加热）/4 °C（保存）/−20 °C（储存）；时间：5 min（加热）/1 h（TCEP处理）/24 h（孵育）/30 min（离心）；pH：8.0（DNA稀释缓冲液）/7.4（肽固定缓冲液）

2.2 PKA电化学生物传感器的构建

玻碳电极（直径3 mm）首先用0.3 μm和0.05 μm α-Al₂O₃浆料分别抛光3 min以获得镜面表面，随后依次用去离子水、乙醇、去离子水连续超声清洗。清洗后的电极于25 °C干燥备用。

典型修饰过程如下：首先将5 μL Zr-MOF溶液（2 mg mL⁻¹）滴涂于电极表面，室温静置1.5 h。与此同时，取30 μL 1 × NEBuffer™，含15 μL DNA-Au NPs-肽、200 μM ATP及不同浓度PKA，于37 °C水浴中孵育2 h进行磷酸化反应，随后70 °C加热10 min终止反应，自然冷却至室温。接下来，将磷酸化后的DNA-Au NPs-肽溶液滴加至修饰电极表面，通过肽段与Zr-MOF之间形成的Zr-O-P键组装到电极表面。最后，取10 μL [Ru(NH₃)₆]³⁺（1 mM）滴加至电极表面，通过静电作用与DNA结合。静置1.5 h后，将修饰电极置于电解液中进行电化学测量。每一步反应完成后，电极均用10 mM Tris-HCl和100 mM NaCl（pH 7.4，洗涤缓冲液）缓慢小心冲洗以去除非特异性吸附，并用N₂吹干。

【数据】电极直径：3 mm；α-Al₂O₃粒径：0.3 μm/0.05 μm；抛光时间：3 min；干燥温度：25 °C；Zr-MOF浓度：2 mg mL⁻¹；Zr-MOF修饰量：5 μL；Zr-MOF修饰时间：1.5 h；ATP浓度：200 μM；磷酸化温度：37 °C；磷酸化时间：2 h；终止反应温度：70 °C/10 min；[Ru(NH₃)₆]³⁺浓度：1 mM；体积：10 μL；静置时间：1.5 h；洗涤缓冲液：10 mM Tris-HCl + 100 mM NaCl（pH 7.4）

2.3 材料表征方法

Zr-MOF依据溶剂热法合成。所制备Zr-MOF的形貌和尺寸通过SEM和TEM表征。Au NPs的形貌通过TEM观察，粒径分布通过随机测量90个纳米颗粒获得。Zr-MOF的晶体结构通过XRD分析，化学组成通过FT-IR和XPS确认。Au NPs的功能化修饰通过UV-vis光谱验证。

【数据】粒径统计数量：90个纳米颗粒；原文未详述SEM/TEM/XRD/FT-IR/XPS的具体仪器型号

研究结果

3.1 PKA电化学生物传感器原理

基于Zr-MOF和[Ru(NH₃)₆]³⁺的PKA电化学生物传感器的构建流程如图6所示。肽和DNA通过Au-S键自组装在Au NPs表面，形成DNA-Au NPs-肽复合物。Zr-MOF作为电极基底，具有大比表面积和丰富孔隙，有利于电荷转移和客体分子捕获，从而增强传感器灵敏度。在PKA催化下，ATP的磷酸基团转移至肽段的丝氨酸残基，发生磷酸化修饰；磷酸化后的DNA-Au NPs-肽复合物通过磷酸化肽段与Zr-MOF纳米花之间形成的Zr-O-P键共价固定在电极表面。[Ru(NH₃)₆]³⁺通过静电作用与DNA结合，并在电极表面参与氧化还原反应，引起电化学信号变化。由于PKA活性直接影响电极表面固定的DNA量，进而控制[Ru(NH₃)₆]³⁺的负载量，因此可通过监测电化学响应的变化实现对PKA活性的定量检测。

3.2 Zr-MOF与DNA-Au NPs-肽的表征

Zr-MOF通过溶剂热法合成。SEM和TEM表征结果（图1A和B）显示，所制备的Zr-MOF呈现均匀的纳米花形貌，平均直径约2.5 μm。这些纳米花由数十片相互穿插的超薄二维纳米片构成，纳米片表面光滑，横向尺寸延伸至微米尺度，厚度低于10 nm。

图1C和D展示了Zr-MOF的XRD和FT-IR表征结果。如图1C所示，合成的Zr-MOF的实验XRD图谱在5.93°、10.16°、21.12°和26.79°处出现四个衍射峰，对应晶面分别为(100)、(110)、(130)和(401)，与文献报道一致。如图1D所示，Zr-MOF在3418 cm⁻¹处的峰归属于O-H的伸缩振动；1594 cm⁻¹处的特征峰归属于有机配体中O-C-O基团的对称和不对称伸缩振动；1401 cm⁻¹附近的吸收来源于芳香环的C-C振动；1316 cm⁻¹处的峰对应配体的C-N单键振动；900至1200 cm⁻¹范围内的特征峰归属于Zr-O键的伸缩振动；778 cm⁻¹处的吸收归属于4,4′,4″-三羧基三苯胺配体中的单取代结构。此外，507 cm⁻¹和658 cm⁻¹处的峰分别与Zr-MOF结构中Zr₆O₄(OH)₂(COO)₁₂单元的μ₃-OH和μ₃-O基团的伸缩振动相关。

为进一步确认Zr-MOF纳米花的化学组成，进行了XPS分析。如图1E所示，全谱扫描显示C、N、O和Zr的信号，证实Zr-MOF纳米材料的成功制备。高分辨谱进一步表征了各元素的电子态：Zr-MOF的C 1s谱（图S1A）显示C-C、C-O和C=O键的存在，结合能分别为283.34 eV、286.03 eV和288.7 eV；N 1s谱（图S1B）在399.08 eV和400.18 eV处出现对应C-N和NH₃⁺的峰；O 1s谱（图S1C）在530.37 eV、531.87 eV和533.21 eV处的结合能表明Zr-O-Zr、Zr-C-O和C-O-O基团的存在；Zr 3d谱（图S1D）中182.77 eV和185.16 eV处的峰分别归属为Zr 3d₅/₂和Zr 3d₃/₂。上述结果共同验证了Zr-MOF纳米花的成功合成。

Au NPs的形貌和尺寸通过TEM表征。如图1F所示，所得Au NPs呈球形结构，尺寸均匀，分散性优异。通过随机测量90个纳米颗粒评估粒径分布，平均直径为13.7 nm（图1F插图）。UV-vis光谱确认了Au NPs的成功功能化。如图S2所示，Au NPs在519 nm处呈现特征吸收峰，归因于其表面等离子体共振。当DNA和肽成功偶联至Au NPs表面后，吸收峰红移至523 nm，同时在256 nm处出现DNA特征吸收峰。上述结果共同表明DNA和肽成功固定在Au NPs上。

【数据】Zr-MOF平均直径：约2.5 μm；纳米片厚度：<10 nm；XRD衍射峰：5.93°、10.16°、21.12°、26.79°；FT-IR特征峰：3418、1594、1401、1316、900–1200、778、507、658 cm⁻¹；XPS结合能：C 1s（283.34/286.03/288.7 eV）、N 1s（399.08/400.18 eV）、O 1s（530.37/531.87/533.21 eV）、Zr 3d（182.77/185.16 eV）；Au NPs平均粒径：13.7 nm；UV-vis吸收峰：519 nm（Au NPs）/523 nm（偶联后）/256 nm（DNA）

3.3 电化学分析

为验证所开发电化学生物传感器的逐步修饰过程，以5 mM [Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻（含0.1 M KCl）为电化学氧化还原探针进行循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）表征。如图2A和B所示，裸玻碳电极呈现一对可逆的氧化还原峰（图2A曲线a）和较小的半圆区域（图2B曲线a），表明其优异的导电性。经Zr-MOF修饰后，峰电流降低（图2A曲线b），电子转移电阻（Rₑₜ）增至850 Ω（图2B曲线b），这可归因于Zr-MOF适中的导电性。组装PKA磷酸化的DNA-Au NPs-肽后，峰电流进一步下降（图2A曲线c），Rₑₜ增至4035 Ω（图2B曲线c）。这一现象源于PKA存在下5′-OH末端肽段的磷酸化，增强了电极表面的电负性，阻碍了电子转移。然而，固定[Ru(NH₃)₆]³⁺后，峰电流增加（图2A曲线d），Rₑₜ显著降至702 Ω（图2B曲线d），主要原因是[Ru(NH₃)₆]³⁺作为电活性物种促进了电极界面的电子转移，增强了电荷转移动力学。CV和EIS在逐步修饰过程中呈现的一致趋势证实了电化学生物传感器的成功构建。

为验证该传感策略用于PKA活性检测的可行性，在PBS溶液中测量了不同修饰电极的DPV响应。图2C展示了修饰电极在不存在和存在100 U mL⁻¹ PKA时的DPV响应。在无PKA时，电化学工作站记录到极小的峰电流（图2C曲线a）。然而，当PKA引入体系后，峰电流显著增加（图2C曲线b）。该增强可归因于肽和DNA通过Au-S键自组装到Au NPs上形成DNA-Au NPs-肽复合物。PKA的存在诱导肽段5′-OH末端磷酸化，使DNA-Au NPs-肽通过磷酸化肽段与Zr-MOF之间形成的Zr-O-P键固定在电极表面。[Ru(NH₃)₆]³⁺随后通过静电作用与DNA结合并组装到电极表面，参与氧化还原反应从而放大电化学信号。因此，PKA活性直接决定可用DNA浓度，进而调节[Ru(NH₃)₆]³⁺的负载量，DPV信号间接由PKA活性决定。该结果表明所提出的传感策略用于PKA活性检测的可行性，进一步证实了电化学传感器的成功构建。

【数据】氧化还原探针：5 mM [Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻ + 0.1 M KCl；Rₑₜ值：裸GCE未详述/Zr-MOF/GCE 850 Ω/PKA-DNA-Au NPs-peptide/Zr-MOF/GCE 4035 Ω/[Ru(NH₃)₆]³⁺修饰后702 Ω；PKA浓度：100 U mL⁻¹

3.4 实验条件优化

为优化所开发生物传感器的检测性能，对关键实验参数进行了系统考察。图3显示了不同PKA浓度下传感器的DPV响应曲线及对应的峰电流。随着PKA浓度从0增至100 U mL⁻¹，DPV峰电流逐渐增大。

【数据】PKA浓度梯度：0、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100 U mL⁻¹；缓冲液：10 mM PBS（pH 7.4）+ 0.5 M NaCl + 5 mM MgCl₂

3.5 传感器分析性能

在最优实验条件下，传感器的响应信号与PKA浓度的对数在0.05至100 U mL⁻¹范围内呈现良好的线性关系，检出限为0.016 U mL⁻¹。

选择性评估结果如图4A所示，该生物传感器能够区分PKA与干扰物质。重现性评估结果如图4B所示，所有测量均在PKA浓度为100 U mL⁻¹的条件下进行，误差棒表示三次重复测量的相对标准偏差（RSD）。

【数据】线性范围：0.05–100 U mL⁻¹；检出限：0.016 U mL⁻¹；PKA检测浓度：100 U mL⁻¹；重复测量次数：3次

3.6 抑制剂评价与细胞裂解液检测

为评估该传感器在抑制剂筛选中的应用潜力，以H-89为模型PKA抑制剂进行了抑制实验。图5A展示了不同浓度H-89对PKA活性的抑制效果，图5B为抑制率与H-89浓度之间的剂量-响应关系。实验所用PKA浓度为100 U mL⁻¹。结果表明该传感器可用于PKA抑制剂的筛选评估。

【数据】PKA浓度：100 U mL⁻¹；原文未详述H-89的具体浓度梯度及IC₅₀值

讨论与解读

本文构建了一种基于Zr-MOF和电活性分子[Ru(NH₃)₆]³⁺的无标记信号放大电化学生物传感器用于PKA活性检测。在该方法中，PKA的存在诱导5′-OH末端肽段的磷酸化，随后DNA-Au NPs-肽复合物通过磷酸化肽段与Zr-MOF之间形成的Zr-O-P键组装到电极表面。电活性分子[Ru(NH₃)₆]³⁺通过静电作用被DNA捕获，从而实现电化学信号的放大。该传感器展现出优异的分析性能，适用于抑制剂筛选以及复杂细胞样品中PKA活性的检测，在激酶相关药物开发、早期疾病诊断和治疗效果评估方面具有广阔的应用前景。

编译者解读

该研究在传感器设计中展现了巧妙的"信号开关"逻辑——Zr-MOF既是电极基底又充当磷酸化捕获界面，[Ru(NH₃)₆]³⁺则通过DNA静电吸附实现信号放大，两步设计环环相扣。Zr-O-P键的引入是对传统抗体识别策略的替代性创新，规避了生物识别元件的稳定性问题。但需注意，该体系对非特异性吸附的抑制仅依赖BSA封闭，在复杂生物基质中的抗干扰能力仍需更多数据支撑。从合成生物学视角看，这种"磷酸化触发-界面固定-电信号输出"的模块化设计思路，或可为其他激酶传感器的开发提供可迁移的通用平台范式。

参考来源

Men, X. Zr-MOF based electrochemical biosensor coupled with [Ru(NH₃)₆]³⁺ mediated signal amplification for detection of protein kinase A. Bioelectrochemistry, 2027. DOI: 10.1016/j.bioelechem.2026.109410

DOI: 10.1016/j.bioelechem.2026.109410