来源：High-level de novo biosynthesis of plant-derived pinosylvin in Yarrowia lipolytica via metabolic engineering and surfactant-mediated fermentation（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
赤松素（pinosylvin）是一种存在于松木心材中的天然二苯乙烯类化合物，具有抗菌、抗氧化、抗炎及抗癌等多种药理活性，但其植物提取法效率低且不可持续。本研究以产油酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为底盘细胞，通过引入异源PAL、4CL和STS酶构建赤松素生物合成途径，结合多拷贝基因整合、莽草酸途径代谢流强化及脂质合成途径改造，最终在摇瓶水平将赤松素产量提升至774.65 mg/L——这是迄今报道的最高水平。研究还发现表面活性剂辅助发酵可有效缓解赤松素的细胞毒性并促进其胞外分泌，为细胞毒性天然产物的微生物高效合成提供了新范式。
研究背景
赤松素（反式-3,5-二羟基二苯乙烯）是一种植物二苯乙烯类多酚化合物，主要存在于多种松属植物的叶片和木材中，其浓度在病原菌和昆虫侵袭时会升高。近年研究表明，赤松素及其衍生物具有广谱抗寄生虫和抗病毒活性，以及抗菌、抗氧化、抗癌和抗炎等多种药理效应。凭借这些特性，赤松素已成为开发环境友好型农药和杀虫剂的重要研究对象，在医药和保健领域展现出可观的市场潜力。
目前赤松素主要通过植物提取获得，但多步分离纯化流程导致该方法效率低下且不可持续。化学合成虽可行，但二苯乙烯类化合物的复杂结构和伴随的异构体形成严重制约了高效生产。近年来，随着合成生物学的发展，多种植物次生代谢产物已能在微生物中实现高效生产——这为赤松素的可持续获取提供了新的可能。解脂耶氏酵母作为一种产油酵母，具有高水平的胞内丙二酰辅酶A供给，是合成赤松素的理想底盘细胞。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用菌株列于表1（原文Table 1）。E. coli DH5α用于重组质粒构建。E. coli 细胞在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中于37°C、200 rpm条件下培养12 h，抗生素（氨苄青霉素）终浓度为100 mg/L。Y. lipolytica Po1f-Δku70作为起始宿主菌株。Y. lipolytica 及其衍生菌株在YPD20培养基（20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖）中于30°C、200 rpm振荡培养。不含尿嘧啶的合成完全培养基（SC-URA，购自Pyeast Bio. CO. LTD）用于转化子筛选。YPD20培养基中添加0.8 g/L 5-氟乳清酸（5-FOA）和20 g/L琼脂配制成反选平板，用于去除URA3标记。
【数据】LB培养基：10 g/L胰蛋白胨+5 g/L酵母提取物+10 g/L NaCl；E. coli 培养条件：37°C、200 rpm、12 h；氨苄青霉素浓度：100 mg/L；YPD20培养基：20 g/L胰蛋白胨+10 g/L酵母提取物+20 g/L葡萄糖；Y. lipolytica 培养条件：30°C、200 rpm；5-FOA浓度：0.8 g/L；琼脂：20 g/L
2.2 基因删除与过表达
本研究所用全部质粒和引物列于补充材料。带有ACC1基因表达盒的整合质粒来自先前报道（Wang et al., 2022）。其他整合质粒和删除质粒均参照该报道构建。简要流程如下：构建ARO10（YALI0_D06930g）删除盒时，分别使用引物ARO10-up-F/R和ARO10-down-F/R扩增ARO10上游和下游约1500 bp的同源臂区域。所得PCR片段经EcoR I和Hind III酶切后连接至pUC-HUH载体。DGA1删除盒的构建方式相同。整合质粒构建使用了IntD、IntA、IntC、IntA3和IntF位点。用于赤松素合成的异源基因PtrPAL3（XP_002322884）、Pc4CL1（P14912）、Ptr4CL4（EEF00197）、Ptr4CL5（EEE79804）、PtSTS（AHK13302.1）、PpSTS（ALN42233.1）和VvSTS（DQ459351）均经密码子优化后由通用生物系统（安徽滁州）合成。内源基因（ARO1（YALI0_F12639g）、ARO8（YALI0_E20977g）、ARO3（YALI0_B20020g）、ACC1（YALI0_C11407g））、启动子（PTEF、PGPD1、PFBAin）和终止子（TLIP2t、TXPR2t、TOCTt、TMIG1t）均使用高保真Phusion DNA聚合酶（Vazyme，南京）从Y. lipolytica Po1f基因组中扩增获得。DNA片段使用纯化试剂盒（Takara，大连）进行纯化。重组质粒的构建使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V2（Vazyme，南京）。
【数据】同源臂长度：约1500 bp；限制性内切酶：EcoR I和Hind III；整合位点：IntD、IntA、IntC、IntA3、IntF；PtrPAL3登录号：XP_002322884；Pc4CL1登录号：P14912；Ptr4CL4登录号：EEF00197；Ptr4CL5登录号：EEE79804；PtSTS登录号：AHK13302.1；PpSTS登录号：ALN42233.1；VvSTS登录号：DQ459351；内源基因：ARO1（YALI0_F12639g）、ARO8（YALI0_E20977g）、ARO3（YALI0_B20020g）、ACC1（YALI0_C11407g）；启动子：PTEF、PGPD1、PFBAin；终止子：TLIP2t、TXPR2t、TOCTt、TMIG1t
2.3 酵母转化
重组质粒经限制性内切酶消化实现线性化，随后使用Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research, Orange, CA, USA）将含有基因表达盒的DNA片段转化至Y. lipolytica Po1f-Δku70中。转化子在SC-URA平板上筛选，于30°C培养2–3天。挑取单克隆，使用菌落PCR验证，并通过测序引物测序确认目标基因的正确整合。
【数据】转化试剂盒：Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit；筛选培养基：SC-URA平板；培养条件：30°C、2–3天；验证方法：菌落PCR+测序
2.4 摇瓶发酵
工程菌株在5 mL YPD20培养基中制备种子培养物，于30°C、200 rpm条件下培养20–24 h。摇瓶发酵时，将1%种子培养物接种至新鲜YPD20培养基（20 mL）或含有100 mg/L t-CA的新鲜YPD20培养基中，于30°C、200 rpm条件下培养72 h。为研究浅蓝菌素（cerulenin）对赤松素生产的影响，将1%种子培养物分别接种至含0.5 mg/L和1.0 mg/L浅蓝菌素的新鲜YPD20培养基中，于30°C、200 rpm培养72 h。为探究表面活性剂对赤松素生产的影响，将1%种子培养物接种至新鲜YPD20培养基中，培养18 h后向培养基中添加表面活性剂或有机溶剂，继续培养54 h。为探究葡萄糖浓度对赤松素生产的影响，将1%种子培养物分别接种至新鲜YPD40、YPD60和YPD80培养基（含40、60、80 g/L葡萄糖）中，培养18 h后向培养基中添加表面活性剂，继续培养102 h。
【数据】种子培养：5 mL YPD20、30°C、200 rpm、20–24 h；接种量：1%；发酵体积：20 mL；t-CA补加浓度：100 mg/L；发酵条件：30°C、200 rpm、72 h；浅蓝菌素浓度：0.5 mg/L和1.0 mg/L；表面活性剂添加时间点：18 h后；表面活性剂处理时长：54 h；葡萄糖浓度梯度：40/60/80 g/L；高浓度葡萄糖发酵时长：18 h+102 h
2.5 分析方法
赤松素分析：将0.5 mL发酵液与0.5 mL乙酸乙酯混合，涡旋3 min，随后在12,000 rpm条件下离心1 min。取200 μL上层有机相转移至新管中，于60°C挥发至干。将上述样品重新溶解于200 μL甲醇中，经0.22 μm尼龙膜过滤。最后，标准品和处理后的样品通过高效液相色谱（HPLC）进行分析。HPLC分析在SHIMADZU CTO-16L系统（日本）上进行，配备Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）。流动相为40%乙腈和60%水（水/乙酸，98.5:1.5，v/v），流速为1 mL/min。柱温维持在30°C，检测波长为294 nm。
【数据】萃取：0.5 mL发酵液+0.5 mL乙酸乙酯；涡旋：3 min；离心：12,000 rpm、1 min；上清取量：200 μL；挥发温度：60°C；复溶：200 μL甲醇；滤膜：0.22 μm尼龙膜；色谱柱：Eclipse XDB-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：40%乙腈/60%水（水/乙酸=98.5:1.5，v/v）；流速：1 mL/min；柱温：30°C；检测波长：294 nm
2.6 统计分析
本研究所有数据均以重复样品的平均值±标准差（SD）表示。使用GraphPad Prism（Version 9.5.1）进行Tukey多重比较检验。ns: p > 0.05，p ≤ 0.05，p ≤ 0.01，p ≤ 0.001，****p ≤ 0.0001。统计分析中p ≤ 0.05定义为具有统计学显著性。
【数据】统计软件：GraphPad Prism 9.5.1；显著性阈值：p ≤ 0.05
研究结果
3.1 评估解脂耶氏酵母作为赤松素生物合成底盘细胞的能力
尽管赤松素已在多种微生物中实现了生物合成，但此前尚无在解脂耶氏酵母中生物合成的报道。如图1A所示，在解脂耶氏酵母中生物合成赤松素需要异源表达三个关键基因：PAL、4CL和STS。为获得更好的兼容性，研究人员从不同来源筛选了4CL和STS途径酶，以t-CA为前体构建异源赤松素生物合成途径。三种4CL酶（来自毛果杨的Ptr4CL4、Ptr4CL5和来自欧芹的Pc4CL1）和三种STS酶（来自葡萄的VvSTS、来自黑松的PtSTS和来自意大利石松的PpSTS）以不同组合在Po1f-Δku70菌株中共表达。
值得注意的是，所有九株工程菌株（T01–T09），每株含有不同的酶组合，均成功地从t-CA合成了赤松素，在含100 mg/L t-CA作为底物的YPD20培养基中培养72 h后，产量范围为6.21至23.55 mg/L（图1B）。产量最高的两株菌（T05、T08）共享同一来源（黑松）的STS，赤松素滴度分别为23.55 ± 1.09 mg/L和21.72 ± 0.21 mg/L，表明PtSTS可能比PpSTS更适合在解脂耶氏酵母中从反式肉桂酰辅酶A合成赤松素。然而，先前一项研究报道PpSTS在大肠杆菌中产生的赤松素水平高于PtSTS（Hu et al., 2022），而在解脂耶氏酵母中观察到了相反的趋势。这表明外源基因表达和蛋白质翻译后修饰在不同宿主中存在差异，导致解脂耶氏酵母和大肠杆菌对异源途径优选基因的不同。
此外，发酵过程中观察到一个有趣的现象：对照菌株也表现出t-CA浓度的降低，提示解脂耶氏酵母可能具有内源性的t-CA降解途径。然而，内源性t-CA代谢途径的存在不仅导致目标产物生物合成关键前体的损失，还会导致不需要的副产物的形成，这两者都可能损害微生物细胞工厂的效率。因此，为进一步研究这一现象，构建了一株仅将PtSTS导入Po1f-Δku70的工程菌株T10。令人惊讶的是，菌株T10在补充了100 mg/L t-CA的YPD20培养基中培养72 h后产生了5.93 ± 0.25 mg/L的赤松素（图1C）。菌株T10和对照菌株Po1f-Δku70均在72 h后实现了t-CA的完全转化（100%），但在对照菌株中未检测到赤松素。这些结果表明解脂耶氏酵母具有内源性4CL活性，这与近期关于其4-香豆酰辅酶A合酶基因YALI1_B10231g的研究一致（Zhou et al., 2026）。该内源性4CL活性的编码基因此前被鉴定为脂肪酰辅酶A合酶（Dulermo et al., 2016）。这一发现不仅凸显了该宿主细胞在赤松素生物合成方面的优越性，还揭示了解脂耶氏酵母在生产t-CA衍生化合物方面此前未被认识的生物合成潜力。
【数据】工程菌株数：9株（T01–T09）；赤松素产量范围：6.21–23.55 mg/L；T05产量：23.55 ± 1.09 mg/L；T08产量：21.72 ± 0.21 mg/L；T10产量：5.93 ± 0.25 mg/L；t-CA转化率：100%（72 h）；底物t-CA浓度：100 mg/L；培养时间：72 h；培养基：YPD20
3.2 解脂耶氏酵母中赤松素的从头生物合成
解脂耶氏酵母已被证明具有广泛的底物谱，包括葡萄糖、蔗糖和木糖，并已通过工程改造进一步优化（Ledesma-Amaro and Nicaud, 2016）。建立赤松素的从头生物合成途径不仅高度可行，而且比使用t-CA作为底物更具经济性。解脂耶氏酵母拥有天然的莽草酸途径，可提供中间体L-苯丙氨酸（L-Phe），但其缺乏PAL，无法产生t-CA。此前，该研究团队从毛果杨中鉴定了一个PtrPAL3，已证实可通过全细胞催化将L-Phe（40 mM）有效转化为t-CA，转化率达87.2%（Zhang et al., 2020）。
本文将密码子优化的PtrPAL3基因整合至Po1f-Δku70的IntD位点，获得菌株P01。如图S1所述，含有PtrPAL3的菌株P01在YPD20培养基中培养72 h后积累了142.74 ± 0.26 mg/L的t-CA，表明PtrPAL3能有效将L-Phe转化为t-CA。因此，选择PtrPAL3用于构建以葡萄糖为底物的赤松素从头生物合成途径。如图2A所示，将PtrPAL3基因插入IntA位点的4CL N端或STS C端，产生六个表达盒。将这些表达盒分别导入Po1f-Δku70，生成六株菌（T11–16）。在YPD20培养基中培养72 h后，HPLC分析显示培养物中出现一个与赤松素标准品（保留时间12.598 min）相匹配的明显峰，保留时间为12.564 min（图2B、2C）。随后，在阴离子监测模式下对赤松素标准品和样品进行了LC/MS进一步分析（图S2）。
此外，含有PtrPAL3-Pc4CL1-PtSTS表达盒的菌株T13表现出最高的赤松素滴度，达63.68 ± 0.54 mg/L，高于菌株T14。这一发现表明基因表达位点对PtrPAL3、Pc4CL1和PtSTS的功能至关重要。此外，在相同培养基条件下，PtrPAL3的引入使赤松素滴度比以t-CA为底物时提高了2.7倍，相应的葡萄糖得率为3.18 mg/g。这表明Po1f-Δku70中的赤松素从头生物合成途径已成功构建并具备功能。最后，为评估L-Phe（t-CA的前体）的可利用性是否限制了菌株T13的赤松素生产，在发酵培养基中补充了100 mg/L L-Phe。然而，培养液中未观察到赤松素水平的显著增加（数据未显示），表明L-Phe在此阶段并非限速因素。
【数据】PtrPAL3催化效率：L-Phe（40 mM）转化率87.2%；菌株P01的t-CA积累量：142.74 ± 0.26 mg/L（72 h）；赤松素HPLC保留时间：12.564 min（标准品12.598 min）；T13最高滴度：63.68 ± 0.54 mg/L；滴度提升倍数：2.7倍；葡萄糖得率：3.18 mg/g；L-Phe补加浓度：100 mg/L；培养基：YPD20；培养时间：72 h
3.3 调控基因拷贝数以消除途径瓶颈
在排除前体供给作为限速步骤后，t-CA的积累（如图2A所示）成为关键关注点，因为这一现象可能代表异源途径中的潜在瓶颈。推测异源途径酶活性低可能是该阶段赤松素生产的主要限制因素。为克服这一瓶颈，尝试采用多拷贝策略来提高异源途径中4CL和STS的表达。
首先，向菌株T13中额外引入一个拷贝的Pc4CL1或PtSTS，分别获得菌株T17和T18（图3A）。如图3B所示，在菌株T13中过表达额外拷贝的Pc4CL1（生成菌株T17）对赤松素滴度没有产生积极影响。然而，在T13中过表达额外拷贝的PtSTS（生成菌株T18）与亲本菌株相比，赤松素产量显著提高，表明赤松素生物合成受到STS活性的阻碍，STS是关键的瓶颈。携带两个拷贝PtSTS的菌株T18，其赤松素滴度（100.14 ± 0.57 mg/L）比菌株T13提高了1.6倍。进一步向菌株T13中整合两个或三个额外拷贝的PtSTS，赤松素产量分别提高至120.23 ± 2.93 mg/L（菌株T19）和132.08 ± 0.38 mg/L（菌株T20）。然而，将4CL与STS的拷贝数比例调整至1:5未能使赤松素滴度显著提高，说明1:4的比例是最优组合。总体而言，低STS活性构成了关键的限制因素。
【数据】T18（2拷贝PtSTS）产量：100.14 ± 0.57 mg/L，为T13的1.6倍；T19（3拷贝PtSTS）产量：120.23 ± 2.93 mg/L；T20（4拷贝PtSTS）产量：132.08 ± 0.38 mg/L；最优4CL:STS拷贝数比：1:4；1:5比例无显著提升
3.4 驱动代谢流向莽草酸途径以提升赤松素产量
T20菌株中t-CA的大量积累表明，莽草酸途径中L-Phe的供给可能限制了赤松素的合成。为增强前体供给，研究团队对莽草酸途径进行了系统优化（图4A）。首先，在菌株T20中过表达ARO1（编码五功能酶），获得菌株T21。与菌株T20相比，T21的赤松素产量未显著提高。随后，在T20中分别过表达ARO3和ARO8，获得菌株T22和T23。T22的赤松素产量达到147.49 ± 1.64 mg/L，T23的产量为139.21 ± 0.55 mg/L，均显著高于T20（132.08 ± 0.38 mg/L）。进一步将ARO3和ARO8共同过表达，构建菌株T24，其赤松素产量进一步提升至173.78 ± 1.42 mg/L。
为探究ARO10（编码苯丙酮酸脱羧酶）缺失对赤松素生产的影响，在菌株T24中删除ARO10基因，获得菌株T25。T25的赤松素产量为178.66 ± 1.65 mg/L，略高于T24，但差异未达到统计学显著水平。而删除ARO10后，t-CA的积累量从T24的约500 mg/L降至T25的约200 mg/L，表明ARO10的删除减少了碳流从莽草酸途径的流失，使更多碳流向目标产物。同时，在T25中过表达ACC1（编码乙酰辅酶A羧化酶）构建菌株T26，其赤松素产量达到202.88 ± 2.08 mg/L，较T25提高约13.6%。图4B和4C分别展示了各菌株赤松素和t-CA的产量变化。
【数据】T21（过表达ARO1）：与T20无显著差异；T22（过表达ARO3）产量：147.49 ± 1.64 mg/L；T23（过表达ARO8）产量：139.21 ± 0.55 mg/L；T24（共过表达ARO3+ARO8）产量：173.78 ± 1.42 mg/L；T25（T24+ΔARO10）产量：178.66 ± 1.65 mg/L；T26（T25+ACC1）产量：202.88 ± 2.08 mg/L，较T25提高13.6%；T20产量：132.08 ± 0.38 mg/L
3.5 通过改造脂质合成途径提升赤松素产量
丙二酰辅酶A是赤松素合成的直接前体之一。在解脂耶氏酵母中，丙二酰辅酶A主要被用于脂肪酸合成途径。为增加丙二酰辅酶A向赤松素合成的流向，研究团队对脂质合成途径进行了改造（图5A）。首先，在发酵培养基中添加脂肪酸合成抑制剂浅蓝菌素（cerulenin），浓度分别为0.5 mg/L和1.0 mg/L。结果显示，添加0.5 mg/L浅蓝菌素时，赤松素产量为211.64 mg/L；添加1.0 mg/L时产量为227.31 mg/L，均高于未添加的对照。然而，浅蓝菌素的添加也抑制了细胞生长。
随后，在菌株T26中删除DGA1基因（编码二酰甘油酰基转移酶，催化甘油三酯合成的最后一步），获得菌株T27。T27的赤松素产量达到250.55 ± 3.21 mg/L，较T26提高约23.5%。进一步在T27中额外过表达一个拷贝的ACC1，构建菌株T28，其产量达到255.61 ± 2.47 mg/L，提升幅度不大。图5B展示了各菌株的赤松素产量对比。
【数据】浅蓝菌素0.5 mg/L时产量：211.64 mg/L；浅蓝菌素1.0 mg/L时产量：227.31 mg/L；T27（T26+ΔDGA1）产量：250.55 ± 3.21 mg/L，较T26提高23.5%；T28（T27+额外ACC1）产量：255.61 ± 2.47 mg/L
3.6 非离子表面活性剂对工程菌株生产性能的影响
赤松素对微生物具有一定的细胞毒性，这限制了其高产。为缓解产物毒性并促进赤松素的胞外分泌，研究团队考察了非离子表面活性剂对发酵效果的影响（图6A）。在T34菌株的发酵培养基中分别添加Triton X-100（0.5 g/L）、Tween-80（0.5 g/L）和Tween-20（0.5 g/L）。结果显示，添加Triton X-100的培养基中赤松素总产量最高，达到458.86 mg/L，其中胞外赤松素占比显著提高。Tween-80次之，产量为413.26 mg/L。而未添加表面活性剂的对照组产量仅为255.61 mg/L。
进一步优化碳源浓度，将T34菌株分别在含40 g/L、60 g/L和80 g/L葡萄糖的YPD培养基中发酵，并添加Triton X-100。结果显示，在60 g/L葡萄糖条件下，赤松素产量达到最高值774.65 mg/L（图6B），这是迄今为止摇瓶培养中报道的最高水平。
【数据】Triton X-100（0.5 g/L）处理产量：458.86 mg/L；Tween-80（0.5 g/L）处理产量：413.26 mg/L；Tween-20（0.5 g/L）处理产量：原文未详述；未添加表面活性剂对照：255.61 mg/L；葡萄糖60 g/L时最高产量：774.65 mg/L；葡萄糖浓度梯度：40/60/80 g/L；表面活性剂浓度：0.5 g/L
讨论与解读
本研究通过多种代谢工程策略与表面活性剂介导的发酵策略相结合，验证了解脂耶氏酵母作为赤松素异源生产的可靠平台。通过提高基因拷贝数、改造中心碳代谢以强化前体供给、工程化脂质合成途径、引入表面活性剂介导发酵以及优化碳源浓度，实现了赤松素的高水平积累。解脂耶氏酵母的固有优势与表面活性剂有效缓解产物毒性并促进分泌的策略相结合，为类似细胞毒性高价值化合物的微生物生产提供了可行方案。这项工作也为赤松素未来的工业化规模生物合成提供了宝贵见解。
编译者解读：该研究的核心亮点在于系统性地解决了三个层面的瓶颈——酶活性（STS拷贝数）、前体供给（莽草酸途径与丙二酰辅酶A竞争）和产物毒性（表面活性剂促分泌）。其中"发现内源4CL活性"这一意外收获颇具启发——它提示底盘细胞的隐性代谢能力可能成为构建新途径的"免费资源"。表面活性剂策略的巧妙之处在于不改变代谢网络而直接改变产物分配，这种"物理性解堵"思路对其它细胞毒性天然产物的微生物合成具有普适参考价值。不足之处在于表面活性剂的作用机制尚待深入解析，且目前产量仍限于摇瓶水平，向发酵罐放大时泡沫控制与表面活性剂回收将是新的工程挑战。
参考来源
期刊：Journal of Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.07.001
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.07.001