来源：Synthetic communities of Yarrowia lipolytica for efficient betanin bioproduction through metabolic partitioning（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
合成微生物菌群通过代谢负担分担和任务分配，有望超越单菌株生产系统。本研究在非常规酵母解脂耶氏酵母中筛选出56对可建立互养关系的共营养缺陷型组合，系统表征了不同接种比例下的生长动态与群体分布，并以甜菜红素生产为概念验证，证明互养共培养在微生物反应器条件下效价达136.2 mg/L，较单培养提高1.5倍。该工作为利用解脂耶氏酵母互养菌群生产高代谢需求化合物提供了平台。
研究背景
随着合成生物学工具的快速发展，微生物细胞工厂的基因改造日益复杂。代谢负担、辅因子失衡以及途径中间体的毒性或有限可用性等瓶颈，使单菌株底盘改良逐渐触及天花板，利用合成微生物菌群超越单菌株系统正受到越来越多的关注。受自然界普遍存在的微生物群落启发，由明确成员组成的合成菌群相比单菌株系统具备多项关键优势：代谢通量分配更合理、在挑战性生长条件下对扰动的鲁棒性更强，并能通过伙伴菌株提供的内在酶库获得新功能。然而，建立稳定的合成菌群仍具挑战——菌群内部复杂的通讯与互作网络远比单菌株系统更难理解和控制。核心困难之一在于随时间维持各菌株的群体比例，防止某一成员过度生长导致菌群崩溃。必需代谢物的强制性交叉喂养（互养）是稳定菌群组成、防止群体漂移的有效策略。
研究方法
2.1 菌株、培养基与培养条件
用于质粒增殖的E. coli DH5α细胞在补充了相应抗生素（取决于质粒选择标记）的Luria-Bertani肉汤中培养。本研究使用的所有质粒列于表S1。本研究使用和构建的所有解脂耶氏酵母菌株均衍生自Po1d菌株，列于表S2。所用引物列于表S3。整合到解脂耶氏酵母基因组中的所有异源基因列于表S4。
解脂耶氏酵母常规培养条件为28°C，使用丰富YPD培养基，成分为10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖。转化酵母的选择培养使用补充了相应抗生素的YPD培养基，或酵母合成缺陷型培养基（YNBD），成分为1.7 g/L酵母氮碱（不含氨基酸和硫酸铵）、5 g/L氯化铵、20 g/L葡萄糖和50 mM磷酸钾缓冲液（KH2PO4-Na2HPO4，pH 6.8），并补充相应氨基酸以满足营养缺陷型需求。
甜菜红素生产培养使用改良YNBD培养基，补充40 g/L葡萄糖，其中标准磷酸盐缓冲液替换为此前报道的磷酸钾缓冲液。提高葡萄糖浓度旨在促进甜菜红素苷元（betanidin）的糖基化以生成甜菜红素，缓冲液替换则用于减少副产物形成并维持甜菜红素生物合成的最适pH范围。
试管培养：酵母细胞在8 mL改良YNBD培养基中、28°C、180 rpm条件下培养8天。所有条件的初始接种量统一为OD600（600 nm光密度）= 0.1。共培养时，两菌株以1:1比例接种。
96孔微板培养（用于互养筛选和生长测定）：酵母细胞在200 µL YNBD中、28°C、700 rpm（以减少沉降）条件下培养5天。
BioLector XT培养在48孔花瓣形微板中进行以最大化通气。培养全程连续监测溶解氧和生物量。酵母细胞在28°C、1200 rpm、气流速率25 mL/min条件下培养5天，培养体积为1 mL。
【数据】培养基：YPD（10 g/L酵母提取物+20 g/L蛋白胨+20 g/L葡萄糖）/YNBD（1.7 g/L YNB+5 g/L氯化铵+20 g/L葡萄糖+50 mM磷酸钾缓冲液pH 6.8）/改良YNBD（40 g/L葡萄糖）；温度：28°C；转速：180 rpm（试管）/700 rpm（96孔板）/1200 rpm（BioLector）；时间：8天（试管）/5天（微板）；初始OD600：0.1；培养体积：8 mL（试管）/200 µL（96孔）/1 mL（BioLector）；气流：25 mL/min
2.2 质粒与菌株构建
表达盒和质粒采用Golden Gate克隆法组装，使用此前为解脂耶氏酵母开发的模块化工具包。质粒通过热激转化导入化学感受态E. coli DH5α细胞。阳性克隆经菌落PCR筛选，质粒经提取、限制性酶切验证和Sanger测序确认。经验证的、两侧带有zeta序列的表达盒和质粒通过锂 acetate/DTT转化方案导入解脂耶氏酵母。阳性克隆经菌落PCR和测序筛选。营养缺陷型文库中所有构建菌株的基因破坏均通过测序和补充实验验证。
【数据】克隆方法：Golden Gate；转化方法：热激（E. coli）/醋酸锂-DTT（酵母）；验证方法：菌落PCR+酶切+Sanger测序
2.3 筛选条件
所有营养缺陷型菌株先在YPD培养基中过夜预培养，接种前用蒸馏水洗涤三次以去除残留代谢物。互养筛选实验中，所有两两组合使用OT-2液体处理机器人接种于96孔板。阳性对照（补充相应代谢物）和阴性对照（不补充）与测试的营养缺陷型对并行培养，所有条件设三次重复。培养5天后使用BioTek微板读取仪测量最终OD600值。将所有营养缺陷型对的OD600值与其各自补充了代谢物的单培养对照进行比较，以确定共培养生长是否统计学显著高于对照。
【数据】预培养：YPD过夜；洗涤：蒸馏水×3；筛选平台：96孔板+OT-2机器人；培养时间：5天；检测：BioTek微板读取仪；重复：三次
2.4 流式细胞术群体定量
互养菌群中的群体动态使用Attune NxT流式细胞仪监测。营养缺陷型文库的所有解脂耶氏酵母菌株中，YlMHY1被删除以消除菌丝形成并确保流式结果的可重复性。每株菌用绿色（GFP）或红色（RFP）荧光蛋白标记，以便使用相应激发激光区分每个菌群中的两个亚群。细胞稀释至采集速率为100-1,000事件/秒，采集在10,000事件处停止。不同接种比例根据各菌株预培养物的OD600计算，GFP和RFP标记菌株的实际比例通过流式细胞术验证。
【数据】仪器：Attune NxT流式细胞仪；采集速率：100-1,000事件/s；采集停止：10,000事件；标记：GFP/RFP；基因删除：YlMHY1
2.5 定量PCR分析
每个表达盒基因组整合后，通过定量PCR验证每个整合基因的拷贝数，以确认单拷贝插入。看家基因YlACT1和YlSEC62用作相对定量的参考基因。所有qPCR引物列于表S3。
【数据】参考基因：YlACT1、YlSEC62；验证目标：单拷贝插入
2.6 分析方法
酪氨酸、甜菜红素、异甜菜红素和甜菜红素苷元通过HPLC分析，分析方法的详细信息见图S7图注。由于没有商业化的纯甜菜红素标准品，使用甜菜根提取物作为替代。甜菜青素含量通过其摩尔吸收系数和Beer-Lambert定律在536 nm处测定。计算得出5 g/L甜菜根提取物（Sigma Aldrich, #901266）含8.1 mg/L总甜菜青素，其中4.2 mg/L为甜菜红素、3.9 mg/L为异甜菜红素（图S7），为清晰起见二者统称为甜菜红素。胞外和胞内代谢物均被分析，胞内甜菜红素用水提取。
【数据】检测波长：536 nm；标准品：甜菜根提取物5 g/L（含8.1 mg/L总甜菜青素：4.2 mg/L甜菜红素+3.9 mg/L异甜菜红素）；提取方法：水提取
2.7 数据分析
所有实验数据使用GraphPad Prism 10分析。除非另有说明，所有图中数值以三次重复的平均值±标准差表示。图1C、5B和S1的统计分析使用GraphPad Prism 10进行，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）配合Bonferroni多重比较检验，置信区间为95%。首先确认数据正态性，并使用Brown-Forsythe检验评估方差齐性。显著性阈值在图中标注如下：: p < 0.05, : p < 0.01, : p < 0.001, ****: p < 0.0001。
【数据】软件：GraphPad Prism 10；统计方法：one-way ANOVA + Bonferroni多重比较；置信区间：95%；显著性阈值：p<0.05, p<0.01, p<0.001, ****p<0.0001
研究结果
3.1 解脂耶氏酵母营养缺陷型文库的构建与互养筛选获得56个功能性菌群
要最大化建立多样化互养菌群的概率，必须从足够大的营养缺陷型菌株文库开始。与酿酒酵母不同，解脂耶氏酵母没有大规模敲除突变体文库。在该酵母中，非同源末端连接占主导地位而非同源重组，使得传统基因组编辑方法相对繁琐且缓慢。尽管已有研究致力于简化解脂耶氏酵母的突变体构建，敲除程序仍相对耗时且尚未建立高通量流程。因此，可用于互养测试的解脂耶氏酵母营养缺陷型数量有限，选择用于两两组合的营养缺陷型应基于理性标准而非随机选择。
在酿酒酵母的互养高通量筛选中，Aulakh及其同事发现96%的成功共培养至少包含一个缺失基因与氨基酸或核苷碱基合成相关的成员。为最大化获得解脂耶氏酵母可行互养共培养的概率，营养缺陷型因此被限定为氨基酸和核苷碱基相关基因。共选择19个独特营养缺陷型构建文库，包括4个参与核苷碱基合成的基因和15个参与氨基酸生物合成的基因。所选营养缺陷型包括酿酒酵母互养研究中的一些顶级候选者，以及此前解脂耶氏酵母研究中的全部6个营养缺陷型。还从同一代谢途径中选择了多个营养缺陷型，以评估特定生物合成途径内的中间代谢物交换能否导致互养。
使用CRISPR-Cas9，在表达RFP或GFP的两个YlMHY1缺失亲本菌株（YL_123和YL_136）中删除了19个选定基因。所有可能的171个两两组合以1:1接种比例进行了生长测试（图1A）。营养缺陷型对培养5天后的最大OD600值（作为互养成功建立的指标）绘制在热图中（图1B）。171个筛选对中，56对（32.7%）相比其相应营养缺陷型单培养表现出统计学显著生长（示例见图1C和S1），最大OD600值范围跨度大（0.2-1.9）。
56个筛选菌群的最大OD600值被任意分级并归入三个亚组（图S2）：高效（OD600 > 0.8）、中等（0.4 ≤ OD600 ≤ 0.8）和弱互养建立（OD600 < 0.4）。本研究中，最高最大OD600值的菌群集中在少数"通用型"营养缺陷型周围，如Δtrp1或Δtrp4，它们与几乎所有伙伴均表现出广泛兼容性。还鉴定了一个兼容营养缺陷型簇——三个精氨酸营养缺陷型（Δarg1、Δarg2和Δarg3）中的每一个都与以下五个营养缺陷型中的任意一个兼容：Δmet5、Δtrp1、Δtrp4、Δura1和Δura3（图1B）。相反，任何包含Δade2或Δaro2的组合均未能产生可行互养菌群。一些在酿酒酵母中能促成成功菌群的营养缺陷型（如参与腺嘌呤或组氨酸合成的基因），在解脂耶氏酵母菌群中却产生了显著较低或无法检测到的生长。这表明两个物种具有不同的代谢特征，生物合成输出和营养需求存在差异。
【数据】筛选组合数：171对；成功组合：56对（32.7%）；OD600范围：0.2-1.9；分级阈值：高效>0.8，中等0.4-0.8，弱<0.4；基因数：19个（4个核苷碱基+15个氨基酸）；菌株标记：RFP/GFP
3.2 三种接种比例下的菌群表征揭示多样的生长与群体动态
为更好地理解这56个互养菌群内部的互作动态，我们分析了其生长动力学和群落组成。该表征包括群体动态分析，以及更不平衡的初始接种比例对互养建立的影响——此前研究表明这是酿酒酵母菌群生长动态的关键决定因素。
首先，我们考察了"高效组"的生长动态——该组由56个筛选候选物中在1:1接种比例下表现最佳的14个菌群组成。观察到了多样的生长模式，每种生长类型的代表绘制于图2A和图S2中。
五对组合（Δaro7-Δtrp2、Δtrp1-Δtrp2、Δaro7-Δtrp1、Δaro7-Δtrp4和Δarg3-Δura1）表现出常规指数生长，相比其他菌群具有较短的延迟期（图S3A）。四对组合（Δtrp4-Δthr4、Δtrp4-Δura1、Δarg2-Δura1和Δarg2-Δura3）表现出线性生长动力学，延迟期显著超过24小时（图S3B）。图S3C显示其余五对组合（Δtrp1-Δleu2、Δtrp1-Δura3、Δtrp4-Δtrp2、Δmet5-Δtrp1和Δlys5-Δtrp1）表现出二次生长（diauxic growth）现象。
观察到的生长模式多样性表明，不同菌群对互养启动的要求各不相同。这些差异可能由供体菌株提供的代谢物供应与相应受体菌株所需的最低代谢物阈值之间的平衡所驱动。在此，供体被定义为必须首先启动生长以为受体提供必需代谢物的菌株。除涉及同一途径营养缺陷型的菌群（如Δtrp1-Δtrp2）外，供体和受体菌株不经大量表征难以轻易识别。然而，观察到的延迟期时长差异可能归因于交换代谢物达到临界浓度阈值所需的时间——该阈值由受体的特定需求决定。这一初始延迟可能反映了供体与受体之间代谢界面尚未优化，代谢物供应与需求尚未有效耦合。在此类互养菌群中，代谢物交换是双向的，两株菌同时充当供体和受体。
为进一步阐明相关动态，通过流式细胞术在培养期间监测了14个表现最佳菌群的群体分布。所有测试菌群均观察到群体分布的异质性（图S4A），与此前观察到的生长动态多样性相呼应。各菌群的群体分布从高度偏斜到近乎均等不等。尽管大多数组合由单一成员主导（如Δtrp1-Δtrp2或Δarg2-Δura1组合，图2B-D），其他组合（如Δtrp1-Δmet5菌群）则表现出明显更均衡的群体分布。值得注意的是，根据图S3A，大多数测试菌群在培养三天内——即培养物达到最大OD600之前——就已建立群体平衡。即使在具有较长延迟期的菌群中（图S3B），这种早期稳定化也能实现，突显了菌群稳定化在多样化生长动力学中的鲁棒性。
接下来，在所有56个筛选菌群中测试了20:1和1:20的初始接种比例，以确定更不平衡的起始群体是否能改变生长动态、群体组成和稳定性。虽然大多数菌群在此类不平衡比例下表现出生长减少，但若干菌群的表现显著优于1:1接种比例（红色星号，图3）。
这些结果表明，特定的起始比例有利于互养的启动。因此，以相等的初始比例开始培养可能并非所有菌群的最优条件。
【数据】测试组合数：56对；接种比例：1:1、20:1、1:20；培养时间：5天；延迟期：>24小时（部分组合）；稳定化时间：3天内；高效组：14对
3.3 互养共培养中甜菜红素的生产
（注：原文结果节选至3.2节末尾，3.3节内容以摘要和图表清单中的信息为准进行编译）
甜菜红素生物合成途径从葡萄糖出发，经酪氨酸等多步酶促反应生成甜菜红素苷元，再经糖基化生成甜菜红素（图4A）。甜菜红素和酪氨酸表达盒的所有基因均在强组成型TEF启动子（前接8个上游激活序列）控制下表达（图4B）。
在微生物反应器条件下，使用营养缺陷型组合BB:Δaro7-BT:Δtrp4，在不同初始接种比例和接种量下进行甜菜红素生产（图5A）。通过代谢负担在不同共培养设计间的重新分配，互养共培养在微生物反应器条件下获得了更高的甜菜红素效价——136.2 mg/L，较单培养提高1.5倍。
【数据】甜菜红素效价：136.2 mg/L（互养共培养）；提高倍数：较单培养1.5倍；培养平台：48孔微板（BioLector XT）；培养时间：5天；菌株组合：BB:Δaro7-BT:Δtrp4
讨论与解读
本研究建立了解脂耶氏酵母最大的互养菌群营养缺陷型库，获得56对能够形成强制性互利互作、无需补充必需代谢物即可维持生长的共营养缺陷型组合。发现接种比例是互养建立的关键因素——将初始筛选从1:1扩展到更宽的起始比例范围可能发现更多功能性互养组合。此外，由于互养启动失败可能归因于交叉喂养建立前代谢物耗尽，过表达交换代谢物的生物合成途径或可揭示更多菌群。对筛选菌群的后续表征揭示了生长动力学和群体动态的多样性。研究还证实，一旦特定组合间的互养建立，群体在不同接种比例下保持稳定，受起始比例影响极小。然而，需要跨多代（即连续传代）的更深入表征以确保长期稳定性——这对菌群在工业条件下的适用性至关重要。56个已鉴定菌群中，34个包含至少一个AAA生物合成途径基因缺失的伙伴，凸显了氨基酸生物合成在互养建立中的主导作用。
编译者解读：该研究在合成生物学领域的方法论价值突出——通过理性设计营养缺陷型组合构建稳定菌群，巧妙规避了合成菌群中常见的群体漂移难题。以天然色素甜菜红素为概念验证产品，展示了互养菌群"分工合成"策略在处理高代谢负担化合物生产中的实际优势。值得关注的是，该平台化策略具有可扩展性：将互养模块与不同生物合成通路组合，有望推广至其他高价值天然产物的微生物生产。局限在于，目前互养菌群在规模化发酵中的长期传代稳定性尚未充分验证，从微板到工业反应器的放大效应也需进一步考察。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135437
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135437