来源：Accelerating yeast adaptation: harnessing thermal stress for genomic diversification and thermotolerance in Yarrowia lipolytica（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
温度敏感性是产油酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）工业应用的主要瓶颈。本研究将突变累积实验与全基因组测序相结合，系统描绘了该酵母在37°C下的突变景观。结果显示，与最适生长温度30°C相比，单核苷酸变异和短插入缺失分别增加29倍和68倍。机制解析表明，热致突变并非依赖易错跨损伤合成与非同源末端连接通路，而是源于DNA聚合酶复制保真度下降和错配修复系统不堪重负。长读长测序进一步揭示了端粒不稳定和染色体大尺度重排。功能基因组学鉴定出YALI1_B03404g为耐热性的关键负调控因子，其缺失可显著增强菌株耐热性。
研究背景
酵母作为单细胞生物，在自然栖息地和工业环境中频繁遭遇各种环境胁迫。高温是破坏细胞稳态的首要挑战之一，常导致蛋白质折叠受损、膜完整性破坏和代谢通量紊乱。在模式酵母酿酒酵母中，已鉴定出多种保守的耐热机制，包括热休克蛋白诱导、保护性海藻糖积累、应激颗粒组装、膜脂组成调节及抗氧化防御系统激活。
热胁迫不仅引起即时的生理扰动，还深刻影响基因组稳定性。已有研究表明，酿酒酵母在超适温（38–42°C）下培养可使单核苷酸变异增加四倍，且变异分布无热点区域。严重热休克（52°C）可触发杂合性丢失急剧上升及染色体畸变增加100倍，包括大尺度重排和非整倍体。然而，对于解脂耶氏酵母这一非模式产油酵母，热胁迫如何影响其基因组完整性，此前知之甚少。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用全部解脂耶氏酵母菌株详见表1。野生型菌株W29（ATCC 20460）作为突变累积实验的亲本菌株。遗传工程与功能验证以实验室菌株PO1f为起始背景（表1）。为通过CRISPR/Cas9系统实现高效基因组编辑，将CAS9表达盒整合至PO1f基因组，获得菌株PPF（MATA leu2-270 ura3-302 xpr2-322 axp1-2 int::CAS9-LEU2 LYS9-Δ int::LYS9）。菌株构建所用寡核苷酸列于数据集S1。常规培养采用YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）。
【数据】菌株：W29（ATCC 20460）、PO1f、PPF；培养基：YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）
2.2 解脂耶氏酵母突变累积实验
为探究热条件下解脂耶氏酵母的基因组变化，将10–20个独立分离株在固体YPD培养基上于35°C（PO1f背景）或37°C（W29背景）连续传代10–20轮。每轮从YPD平板上随机挑取一个单菌落，划线接种至新鲜YPD平板，随后于35°C或37°C培养3天。通过计数克隆内全部细胞，计算得出从单个细胞到形成克隆约经历25次细胞分裂。
【数据】传代温度：35°C（PO1f背景）或37°C（W29背景）；传代周期：3天/轮；细胞分裂数：约25次/克隆；传代数：10–20轮；独立分离株数：10–20个
图1 基因删除与蛋白表达的质粒构建策略。（A）用于同时表达靶向特定基因座的双gRNA的质粒pU2gR示意。（B）pNB03404_YFP为荧光标记蛋白表达载体。（C）YALI1_B03相关构建示意。
2.3 DNA提取与全基因组测序
DNA提取与下一代测序参照本课题组近期研究进行。简要而言，使用商品化DNA提取试剂盒（Apostle MiniGenomics）从约1 × 10⁸个解脂耶氏酵母细胞中提取基因组DNA。DNA文库采用VAHTS® Universal Plus试剂盒（Vazyme）配合MGI Adapter Set 8构建。连接完成后，使用VAHTS® Circularization Kit将文库环化。利用MGISEQ-2000RS试剂盒生成DNA纳米球后，在MGISEQ-2000平台上以2 × 150 bp双端模式测序。原始读段经FastQC进行质量控制，Trimmomatic用于去除接头和低质量修剪（Phred评分阈值=20）。
【数据】细胞量：约1 × 10⁸；测序平台：MGISEQ-2000；测序模式：2 × 150 bp双端；Phred阈值：20；DNA提取试剂盒：Apostle MiniGenomics；文库构建：VAHTS® Universal Plus kit（Vazyme）+ MGI Adapter Set 8
2.4 SNV与小插入缺失（InDels）检测
使用BWA-MEM算法以默认参数将干净读段比对至解脂耶氏酵母参考基因组（RefSeq登录号：GCF_001761485.1）。比对结果经SAMtools处理生成排序BAM文件及后续mpileup格式。以mpileup文件为输入，采用VarScan鉴定SNV和InDels。为评估这些突变对蛋白编码序列的功能影响，利用预注释的解脂耶氏酵母基因组数据库通过SnpEff进行分析。突变率计算方式如下：SNV或InDels数量/解脂耶氏酵母基因组碱基数/总细胞分裂数。
【数据】参考基因组：GCF_001761485.1；比对工具：BWA-MEM（默认参数）；突变鉴定：VarScan；功能注释：SnpEff
2.5 DNA拷贝数变异分析
以排序BAM文件为输入，使用Bedtools计算解脂耶氏酵母分离株基因组的测序覆盖度（DNA拷贝数）。每个样本的覆盖度以1000 bp为窗口、500 bp为滑动步长计算。
【数据】窗口大小：1000 bp；滑动步长：500 bp
2.6 解脂耶氏酵母RNA-seq
酵母细胞在25 mL YPD培养基中、30°C条件下持续振荡培养至对数中期（OD600 = 1）。随后培养物于30°C（对照）或瞬时转移至37°C处理2小时。之后通过4,000 g离心5分钟收集细胞。使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）按制造商说明书从解脂耶氏酵母培养物（每个菌株三个独立培养物）中提取总RNA。RNA文库采用NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit（New England Biolabs）按制造商方案制备。RNA-seq文库在Illumina NovaSeq 6000平台上测序，产生双端读段（150 bp）。FASTQ格式的原始序列数据经FastQC评估读段质量，随后使用Trimmomatic去除低质量读段和接头序列。干净读段通过STAR比对器比对至解脂耶氏酵母基因组。基因表达水平通过featureCounts计数比对至各基因的读段进行定量。差异基因表达分析使用R中DESeq2包进行。
【数据】培养体积：25 mL YPD；生长温度：30°C；热激条件：37°C、2 h；离心：4,000 g、5 min；OD600：1.0；生物学重复：3个独立培养物；测序平台：Illumina NovaSeq 6000；读段长度：150 bp双端
2.7 遗传操作
使用双sgRNA表达质粒pU2gR在解脂耶氏酵母PPF中进行基因删除。该系统可在单个靶基因内同时引入两个DNA双链断裂，从而提高敲除效率。靶向特异性sgRNA序列通过CRISPOR网络工具鉴定，随后经PCR整合至pU2gR骨架，所用引物5′端带有包含间隔序列的突出端。引物序列见数据集S1。
为研究Yali1_b03404p蛋白的亚细胞定位，构建了表达载体pNB03404_YFP。该质粒在合成杂合启动子P2_4UASxpr-TEF控制下编码N端YFP融合蛋白。载体还携带URA3选择标记和源自质粒GGE067（https://www.addgene.org/120784/）的逆转录转座子来源重复序列（Zeta），用于稳定基因组整合。
为界定Yali1_b03404p的功能结构域，构建了三个框内内部缺失变体。这些变体分别缺失氨基酸2–131、151–222和545–607的编码区，产生质粒pUZB03404g_d2-131a、pUZB03404g_d151-222a和pUZB03404g_d545-607a。
为构建YALI1_B03404g过表达菌株，从先前构建的PUZB03404质粒扩增Zeta_NotI-up-YALI1_B03404g-URA3-Zeta_NotI-down片段，并导入野生型菌株PPF。上述质粒或PCR扩增的整合片段（Zeta_NotI-up-B03404g_d2-131a-URA3-Zeta_NotI-down、Zeta_NotI-up-B03404g_d151-222a-URA3-Zeta_NotI-down和Zeta_NotI-up-B03404g_d545-607a-URA3-Zeta_NotI-down）采用标准ssDNA/PEG/LiAc法转化至解脂耶氏酵母菌株。正确整合和基因破坏通过位点特异性PCR和Sanger测序验证。
【数据】sgRNA设计工具：CRISPOR；启动子：P2_4UASxpr-TEF；筛选标记：URA3；整合序列：Zeta重复序列；转化方法：ssDNA/PEG/LiAc；缺失氨基酸区域：2–131、151–222、545–607
2.8 统计分析
突变率的95%置信区间基于泊松分布计算。为评估自发与热诱导（致突变）条件下突变率差异的统计学显著性，采用Wilcoxon秩和检验（又称Mann-Whitney U检验）。
【数据】统计方法：泊松分布95% CI、Wilcoxon秩和检验
2.9 数据可用性
解脂耶氏酵母分离株全基因组测序原始数据已存入SRA数据库，登录号为PRJNA1444363。
【数据】SRA登录号：PRJNA1444363
图2 解脂耶氏酵母菌株在30°C和37°C下的生长与突变率。（A）菌株W29在25 mL YPD中、30°C和37°C下的生物量形成。初始OD600为0.05。（B）菌株W29的突变累积实验与基因组测序。（C）SNV的突变谱与比率。
研究结果
3.1 热胁迫严重损害解脂耶氏酵母的基因组稳定性
野生型解脂耶氏酵母菌株W29在30°C液体YPD培养基中培养时，最大生长速率为0.25 h⁻¹。暴露于37°C高温导致最大生长速率降低65%，并伴随生物量积累减少（图2A）。
为探究高温是否损害基因组完整性，进行了突变累积实验。将菌株W29的10个独立分离株在YPD琼脂上于37°C连续传代20轮（图2B）。平行地，21个对照分离株在30°C维持约100代以积累可比数量的突变，确保统计稳健性。所有分离株的基因组DNA经全基因组测序分析，每个分离株获得至少2 Gb的高质量读段。读段比对至解脂耶氏酵母参考基因组以鉴定SNV、InDels和拷贝数变异（CNV）。
在37°C传代的10个分离株中，共鉴定出606个SNV（数据集S2）。基于20.5 Mb的基因组大小和估计的总共5,000次细胞分裂（按25次分裂/代 × 20代 × 10个分离株计算），SNV率为5.91 × 10⁻⁹每碱基每细胞分裂。与30°C下观察到的速率（2.07 × 10⁻¹⁰每碱基每分裂）相比，增加了29倍（图2B）。
突变谱分析（图2C）显示，37°C下最常见的替换类型为C-to-T/G-to-A转换，占所有热诱导SNV的47%，较30°C下观察到的43%略有增加。第二常见类型为A-to-G/T-to-C转换（37°C下27% vs. 30°C下19%），表明转换在热胁迫下比最适温度下发生更频繁（P < 0.05，Fisher精确检验）。就功能影响而言，34%的SNV位于编码区内，包括148个错义突变和4个无义突变（数据集S2）。
此外，在37°C分离株中检测到1,132个InDels（数据集S3），对应速率为1.1 × 10⁻⁸每碱基每分裂。这标志着较30°C下自发InDels速率增加了68倍（图2D）。大多数（78%）热诱导InDels为发生在单核苷酸或微卫星重复序列中的1-bp事件（图2E和数据集S3），这一模式与30°C下的观察一致。这些数据表明，高温可能损害DNA聚合酶的保真度，导致复制 slippage 增加，或可能损害细胞修复此类复制错误的能力。
值得注意的是，91%的InDels定位于非编码区——这一比例显著高于SNV的相应比例。这种差异表明编码序列内的InDels在传代过程中受到更严格的纯化选择。
总体而言，结果表明高温诱导碱基替换的水平与紫外线辐射和甲烷磺酸甲酯等传统强效诱变剂在解脂耶氏酵母中达到的水平相当。然而，高温对InDels的诱变效力似乎显著优于这些化学和物理因子。鉴于这种高诱变效率及其对InDels的独特偏向——后者更可能引起显著的功能多样化——高温处理 emerges 作为一种特别经济、易得且稳健的工业性状改良工具。
【数据】最大生长速率（30°C）：0.25 h⁻¹；37°C生长速率降幅：65%；SNV总数：606；SNV率（37°C）：5.91 × 10⁻⁹每碱基每分裂；SNV率（30°C）：2.07 × 10⁻¹⁰每碱基每分裂；SNV增加倍数：29倍；C-to-T/G-to-A占比：47%（37°C）vs 43%（30°C）；A-to-G/T-to-C占比：27%（37°C）vs 19%（30°C）；编码区SNV比例：34%；错义突变：148个；无义突变：4个；InDels总数：1,132；InDels率：1.1 × 10⁻⁸每碱基每分裂；InDels增加倍数：68倍；1-bp InDels占比：78%；非编码区InDels比例：91%
3.2 热诱导突变不依赖跨损伤合成（TLS）和非同源末端连接（NHEJ）通路
为探究热诱导突变的分子来源，研究聚焦于两条主要的易错修复通路：TLS和NHEJ。TLS通过专门聚合酶（Rev1、Pol ζ和Pol η）绕过DNA损伤实现复制，而NHEJ以不依赖模板的方式修复双链断裂——两者均为已知的SNV和InDels来源。
假设热胁迫触发DNA损伤后由这些通路加工处理，则删除这些通路应改变观察到的突变谱或突变率。为验证这一假设，将野生型菌株（PPF）及缺乏KU70、REV1、REV3或RAD30的突变体在35°C（PO1f背景的最大允许温度）下进行10轮热胁迫。
与假设相反，全基因组测序分析显示，这些关键修复组分的缺失并未显著改变突变频率（图3A）。Δku70、Δrev1、Δrev3和Δrad30背景中的SNV率与亲本菌株相当（范围为8.8 × 10⁻¹⁰至1.6 × 10⁻⁹，对照为1.3 × 10⁻⁹每碱基每分裂；P > 0.05）（图3A和数据集S4）。所有基因型的InDels率同样不受影响（图3A和数据集S4）。
这些发现表明，高温对解脂耶氏酵母的致突变效应独立于TLS介导的损伤旁路合成和NHEJ介导的断裂修复。先前研究表明，高温可诱导间接胁迫因子，如活性氧积累，可能导致氧化碱基损伤和DNA双链断裂。由于碱基切除修复（BER）通路是修复氧化碱基损伤的主要机制，若BER受热胁迫抑制，预期SNV显著增加而InDels频率不会同步激增。然而，这一情景与观察到的InDels速率显著升高不一致。此外，虽然TLS通路通常在损伤碱基旁路合成过程中引入突变，但研究结果表明，TLS或NHEJ通路关键组分的缺失并不改变热胁迫下的突变频率。这些发现共同表明，氧化损伤和双链断裂并非热诱导解脂耶氏酵母突变发生的主要基因毒性驱动因素。
【数据】热胁迫温度：35°C；传代次数：10轮；SNV率范围（突变体）：8.8 × 10⁻¹⁰至1.6 × 10⁻⁹每碱基每分裂；亲本SNV率：1.3 × 10⁻⁹每碱基每分裂；P值：> 0.05
图3 DNA修复通路对解脂耶氏酵母突变率的影响。（A）野生型菌株与缺乏KU70、REV1、REV3和RAD30的突变体在37°C下SNV和InDels率的比较。（B）温度对野生型菌株和msh2突变体SNV和InDels的影响。
3.3 高温培养下复制性DNA聚合酶的保真度受损
DNA复制保真度主要由双层防御系统维持：DNA聚合酶的校对活性和复制后错配修复（MMR）通路。同时破坏这些机制会升高SNV和InDels的速率，通常对InDels的影响更为深远。有趣的是，在解脂耶氏酵母中，高温胁迫mirrors这一模式，诱导的InDels增加比SNV更为显著（图2C）。
这一一致性使研究者假设：热胁迫可能损害DNA聚合酶的校对效率或MMR通路的功能完整性。为验证这一点，构建了MSH2删除菌株以完全消除MMR活性，并在30°C和35°C下进行突变累积实验。
推理逻辑如下：若热诱导突变完全是MMR抑制的结果，则Δmsh2背景中的突变率应不随温度变化而保持恒定。相反，若在缺乏MMR的情况下高温仍继续加剧突变率，则表明热胁迫将原始复制错误增加至超出MMR系统修复能力的水平。
与野生型菌株（PPF）相比，Δmsh2菌株的SNV和InDels率分别飙升至5.9 × 10⁻⁹（增加33倍）和1.1 × 10⁻⁸（增加117倍）（图3B）。当温度升至35°C时，Δmsh2菌株的SNV和InDels频率较其30°C基线进一步增加1倍（图3B）。
这些发现表明，热诱导的点突变主要源于复制错误的 overwhelming influx，超出了MMR系统的处理能力——即高温损害了复制性DNA聚合酶的保真度，使产生的错误数量超过MMR可修复的上限。
【数据】Δmsh2 SNV率：5.9 × 10⁻⁹每碱基每分裂（较野生型增加33倍）；Δmsh2 InDels率：1.1 × 10⁻⁸每碱基每分裂（较野生型增加117倍）；35°C下Δmsh2额外增加：SNV和InDels均增加1倍
图4 高温诱导解脂耶氏酵母大尺度染色体重排。（A-E）37°C下传代的若干分离株中特定染色体的测序覆盖度。红点和蓝点分别表示重复和缺失区域。传代分离株中的染色体重排…
图5 特定突变对解脂耶氏酵母耐热性的贡献。（A）亲本菌株W29与传代分离株在30°C和37°C下的生长比较。（B）三个耐热性较高的传代分离株中检测到的突变子集。（C）基因YALI1_B03404g的删除…
图6 基因YALI1_B03404g的功能探索。（A）Yali1_b03404p蛋白结构域架构的计算预测。（B）Yali1_b03404p-YFP蛋白的亚细胞定位。细胞核经DAPI染色。（C）评估WT、YA…耐热性的比较生长实验。
图7 （无图注）
讨论与解读
本研究系统揭示了热胁迫下解脂耶氏酵母的基因组不稳定性及其耐热机制。在37°C条件下，SNV和InDels分别较30°C增加29倍和68倍。TLS DNA聚合酶和NHEJ通路并未参与热诱导突变；相反，这种突变发生源于DNA聚合酶保真度受损和错配修复系统不堪重负。长读长测序揭示了热胁迫下端粒严重不稳定、大尺度染色体重排以及环形染色体的频繁形成。研究对耐热进化分离株中的突变位点进行了功能验证，并通过基因敲除和互补实验确认了候选基因的作用。YALI1_B03404g被证实为耐热性的关键负调控因子；该基因还调控酵母-菌丝转变，其缺失可显著增强热抗性。
高温作为一种诱变工具，其诱变效率可与紫外线辐射和化学诱变剂相当，且对InDels的偏向性更强——InDels更可能引起功能多样化。这一发现为工业菌株改良提供了极具成本效益且操作简便的新策略。同时，YALI1_B03404g作为负调控因子的鉴定为构建耐热工业菌株提供了明确的遗传靶点。
【编译者解读】该研究的核心价值在于将"高温"这一工业胁迫条件转化为定向进化工具——利用热胁迫自身驱动基因组多样化，而非依赖外源诱变剂。这一策略在工业菌株开发中具有天然优势：无需额外设备与试剂，且InDels偏向性可能产生更丰富的功能变异。YALI1_B03404g的鉴定则为耐热菌株工程改造提供了直接靶点。值得关注的是，该基因同时调控酵母-菌丝转变，提示形态分化与热适应性之间存在潜在关联。后续研究若能阐明其分子机制并评估高温诱变在工业规模发酵中的实际适用性，将推动这一策略从实验室走向产业应用。局限在于，突变累积实验所用传代条件与工业发酵环境仍有差距，工业场景中的实际诱变效果需进一步验证。
参考来源
He M. Accelerating yeast adaptation: harnessing thermal stress for genomic diversification and thermotolerance in Yarrowia lipolytica. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135071
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135071