来源：Reconstruction and metabolic regulation of O-succinyl-L-homoserine biosynthesis pathway in Escherichia coli W3110（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
O-琥珀酰-L-高丝氨酸（OSH）是L-甲硫氨酸生物合成的关键前体，也是多种平台化学品的重要中间产物。本研究以大肠杆菌W3110为底盘菌株，通过多步渐进式优化策略——从解除关键酶反馈抑制、敲除副产物途径，到RBS工程与启动子工程强化前体供给，再到辅因子与能量代谢的全局优化——最终构建出无质粒高产菌株OSHM40，摇瓶产量达20.15 g/L，5-L发酵罐补料分批发酵产量高达104.09 g/L，糖酸转化率64.99%，创下目前无质粒OSH生产菌株的最高纪录。
研究背景
O-琥珀酰-L-高丝氨酸（OSH）是L-甲硫氨酸生物合成中的关键前体，也是多种高价值平台化学品的合成起点，包括高丝氨酸内酯（HSL）、γ-丁内酯（GBL）、琥珀酸和1,4-丁二醇（BDO）等。L-甲硫氨酸是细胞增殖与分化所必需的氨基酸，OSH可在胱硫醚-γ-合酶催化下转化为L-甲硫氨酸，或在O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫解酶催化下直接与甲硫醇反应生成L-甲硫氨酸和琥珀酸。在大肠杆菌中，OSH的生物合成始于葡萄糖经EMP途径转化为丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰辅酶A，经TCA循环生成草酰乙酸，再经一系列催化反应生成L-高丝氨酸，最终由高丝氨酸-O-琥珀酰转移酶（HST，由metA基因编码）催化L-高丝氨酸与琥珀酰辅酶A缩合生成OSH。然而，metA的表达受到转录抑制因子MetJ及终产物L-甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的严格反馈调控，限制了OSH的高效合成。随着全球L-甲硫氨酸需求持续增长，OSH的微生物合成受到广泛关注。
研究方法
2.1 菌株与质粒
本研究所用的重组大肠杆菌菌株和质粒列于表1。质粒构建以大肠杆菌DH5α为宿主菌株。pTarget、pCas和pTrc99A质粒分别用于基因组编辑和基因表达。
【数据】宿主菌株：E. coli DH5α（质粒构建）；基因组编辑质粒：pTarget、pCas；表达质粒：pTrc99A
2.2 基因操作
大肠杆菌W3110中的基因替换采用CRISPR/Cas9系统进行，编辑模板包含500-bp同源臂。编辑质粒通过化学转化导入，所有遗传修饰均经测序验证。详细操作流程参照Liu等（2021）先前描述的方法。
【数据】同源臂长度：500 bp；编辑方法：CRISPR/Cas9；转化方法：化学转化
2.3 摇瓶分批发酵
工程菌株在MS培养基中培养生产OSH。每升培养基组成如下：25 g葡萄糖、16 g (NH₄)₂SO₄、2.5 g酵母提取物、1 g KH₂PO₄、0.5 g MgSO₄、25 g CaCO₃、10 mg FeSO₄·4H₂O、5 mg MnSO₄和2.5 mg ZnSO₄·7H₂O。摇瓶发酵在500-mL摇瓶中进行，每瓶含50 mL MS培养基，30°C、220 rpm振荡培养48小时。
【数据】培养基：MS培养基；葡萄糖：25 g/L；温度：30°C；转速：220 rpm；时间：48 h；装液量：50 mL/500 mL摇瓶
2.4 5-L生物反应器补料分批发酵
OSH补料分批发酵在5-L生物反应器（上海保兴生物设备工程有限公司）中进行，初始工作体积为2 L。初始发酵培养基每升含：20 g葡萄糖、8 g酵母提取物、8 g蛋白胨、4.02 g K₃PO₄、3 g NaCl、2.1 g一水柠檬酸、0.3 g柠檬酸铁铵、2.5 g (NH₄)₂SO₄、0.5 g MgSO₄·7H₂O、1 g甜菜碱、0.4 g琥珀酸和1 g消泡剂。发酵温度维持在30°C。pH用50%（v/v）氨水控制在6.80 ± 0.05。通过调节通气速率和搅拌速度将溶解氧（DO）维持在约25%。补料培养基每升含600 g葡萄糖、15 g KH₂PO₄、12.5 g (NH₄)₂SO₄和1 g甜菜碱，采用pH-stat补料策略自动添加，维持残糖浓度低于1.0 g/L。
【数据】反应器：5-L生物反应器；初始工作体积：2 L；温度：30°C；pH：6.80 ± 0.05（50%氨水控制）；DO：约25%；补料葡萄糖浓度：600 g/L；残糖控制：<1.0 g/L
2.5 分析方法
样品制备：取1 mL发酵液，12,000 rpm离心5 min分离上清和沉淀。沉淀用1 mL HCl溶液（2 mol/L）重悬以溶解培养基中残余的CaCO₃，再次离心。所得沉淀再用1 mL去离子水重悬。细胞生长通过分光光度计测定600 nm处光密度（OD600）监测，其中1个OD600单位对应0.33 g/L细胞干重。OSH定量分析采用高效液相色谱（HPLC），配备C18色谱柱（4.6 × 250 mm，5 μm，Welchrom® Vantage C18）。离心后的上清液在进样检测前经邻苯二甲醛（OPA）进行柱前衍生化。梯度洗脱所用流动相为20 mmol/L乙酸钠、乙腈和甲醇，体积比为1:2:2（v/v），pH调至7.20，每升流动相含180 μL三乙胺和3 mL四氢呋喃。葡萄糖浓度采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定，在540 nm处读取吸光度。
【数据】离心条件：12,000 rpm，5 min；HCl浓度：2 mol/L；OD600与细胞干重换算：1 OD600 = 0.33 g/L DCW；HPLC色谱柱：C18（4.6 × 250 mm，5 μm）；衍生化试剂：OPA；流动相：20 mmol/L乙酸钠:乙腈:甲醇 = 1:2:2（v/v），pH 7.20；葡萄糖测定：DNS法，540 nm
2.6 统计分析
图中所有数据均表示为三次独立生物学重复的平均值±标准差（SD）。采用单因素方差分析（ANOVA）后进行Duncan多重极差检验结合最小显著差数法（LSD）确定统计学显著性（α = 0.05），柱上方不同字母表示差异显著（P < 0.05）。这些统计标注已一致应用于所有相关图表。
【数据】统计方法：单因素方差分析（ANOVA）+ Duncan多重极差检验 + LSD法；显著性水平：α = 0.05，P < 0.05；生物学重复：n = 3
研究结果
3.1 关键酶HST的筛选以提升OSH产量
高丝氨酸琥珀酰转移酶（HST，由metA基因编码）是OSH生物合成途径中的限速酶，催化L-高丝氨酸与琥珀酰辅酶A缩合生成OSH。该酶的表达和活性受到转录抑制因子MetJ的严格调控，同时受L-甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸等终产物的反馈抑制。解除代谢途径中关键酶的反馈抑制通常是构建工程菌株的第一步。因此，本研究首先通过引入metA基因的反馈抑制抗性突变体对菌株进行改造。已有报道表明，metA Q64E和metA T242A基因编码的酶突变体表现出减弱的反馈抑制，而metA L63F、metA A28V和metA R27C等基因突变也能部分解除抑制。据此，分别将Q64E、T242A、A28V、L63F和R27C突变引入底盘菌株OSHM0的metA基因中，构建了菌株OSHM1~OSHM5。
图2所示的摇瓶发酵结果显示，携带A28V突变的菌株OSHM3产量达到8.75 ± 0.11 g/L，比底盘菌株提高12.06%，且未检测到L-高丝氨酸的积累。分析认为A28V位于连接α-螺旋的表面环区，既不在活性位点附近，也不在底物进入通道中，这些表面环区的突变可能促进HST的正确折叠，从而减轻L-甲硫氨酸对酶的抑制作用。同时，此前研究报道L63F/A28V和Q64E/T242A组合突变在其测试条件下获得了最佳的L-甲硫氨酸和OSH产量。然而，在本发酵体系中，这些组合突变体未能超越单个A28V突变体的表现。这主要归因于HST催化活性与下游产物引起的抑制效应之间的不平衡。因此，选择表现最优且不增加额外代谢负担的A28V突变菌株OSHM3进行后续研究。这表明A28V突变有效解除了HST的反馈抑制，促进了OSH的生物合成，而前体L-高丝氨酸的供给可能在这一阶段成为新的限制因素。
【数据】OSHM3产量：8.75 ± 0.11 g/L；较底盘菌株提高：12.06%；突变位点：A28V（位于表面环区）；L-高丝氨酸积累：未检出
3.2 增强关键前体L-高丝氨酸的生物合成
在上述实验中，催化L-高丝氨酸和琥珀酰辅酶A缩合生成OSH的关键酶已过表达，OSH产量得到提升，且发酵液中未检测到残余L-高丝氨酸。然而，作为必需前体，L-高丝氨酸的胞内供给对进一步提高OSH生物合成至关重要。因此，后续研究通过消除竞争性副产物途径、增强前体L-天冬氨酸（ASP）的供给以及强化ASP-HS生物合成途径来提高L-高丝氨酸的可利用性。
首先，通过敲除竞争性有机酸副产物途径，将碳流重新导向中心前体丙酮酸，从而增加从丙酮酸到L-高丝氨酸的代谢流。在大肠杆菌中，丙酮酸是中心碳代谢途径的关键中间体，可被乳酸脱氢酶和丙酮酸-甲酸裂解酶转化为乳酸和甲酸，或通过磷酸转乙酰酶和乙酸激酶或丙酮酸脱氢酶转化为乙酸。这些有机酸的积累不仅消耗丙酮酸，还会因其细胞毒性抑制细胞生长。对菌株OSHM3发酵液的分析显示，乳酸、甲酸和乙酸显著积累。为减少碳流向这些竞争性副产物并重新导向OSH合成，在菌株OSHM3中依次敲除了关键基因mgsA、pflB、poxB和adhE，构建了菌株OSHM6~OSHM9。
值得注意的是，本实验中敲除mgsA基因优先于ldhA以抑制乳酸积累。在严格好氧条件（约25% DO）下，ldhA基因几乎不表达，因为其转录严格依赖于厌氧环境和低pH。敲除mgsA基因特异性地消除了主要的好氧产乳酸途径，且不影响细胞活力。结合pflB、poxB和adhE的缺失，该修饰最大限度地减少了副产物形成并提高了OSH产量。
图3A的发酵结果表明，敲除pflB和adhE基因分别将OSH产量提高至9.56 ± 0.13 g/L和9.38 ± 0.17 g/L。在菌株OSHM10中组合这些缺失进一步将产量提升至9.77 ± 0.27 g/L，比菌株OSHM3高11.66%。同时，图3B的有机酸分析结果证实，上述基因的敲除减少了相应有机酸的产生。
【数据】OSHM6（敲除mgsA）产量：原文未详述；OSHM8（敲除pflB）产量：9.56 ± 0.13 g/L；OSHM9（敲除adhE）产量：9.38 ± 0.17 g/L；OSHM10（组合敲除）产量：9.77 ± 0.27 g/L，较OSHM3提高11.66%
作为L-高丝氨酸的直接前体，L-天冬氨酸在其合成代谢中起决定性作用。因此，增强L-天冬氨酸的胞内供给对L-高丝氨酸的充分积累至关重要。L-天冬氨酸的生物合成主要通过两条代谢途径：一条是AspC途径，即草酰乙酸（OAA）由天冬氨酸氨基转移酶（由aspC基因编码）催化转化为L-天冬氨酸；另一条是AspA途径，即延胡索酸（FUM）由天冬氨酸解氨酶（由aspA基因编码）转化为L-天冬氨酸。AspC途径消耗NADPH，可能引起胞内氧化还原失衡；而AspA途径则产生还原当量。两条途径之间碳通量分布不平衡会导致胞内氧化还原紊乱，从而降低目标产物的合成效率。因此，平衡AspA和AspC途径的氧化还原状态对关键前体L-天冬氨酸的高效积累至关重要。
RBS工程是在翻译水平上使用的经典调控策略。它可以精确调控不同基因的翻译起始效率，理性设计和微调多基因途径的表达比例，最终优化代谢网络中酶的催化活性。本研究使用RBS设计工具构建了不同RBS强度（500–8000 AU）的aspA和aspC表达盒。以菌株OSHM10为起始菌株，首先通过质粒pTrc99A分别单独过表达两个目标基因，成功构建了菌株OSHM11~OSHM20。
摇瓶发酵结果如图4所示。结果表明，RBS强度为4000 AU和8000 AU的aspA过表达菌株OSH产量增加最为显著，分别达到14.16 ± 0.35 g/L和13.47 ± 0.90 g/L。相比之下，仅在RBS强度为2000 AU的aspC过表达菌株中观察到中等程度的产量提升（10.53 ± 0.20 g/L），而其他所有RBS强度均导致OSH产量下降。推测适度增强AspA途径可重塑碳通量分布，将代谢流导向L-天冬氨酸和OSH的合成。此外，AspC途径消耗草酰乙酸，而AspA途径利用延胡索酸，后者对TCA循环整体稳态的干扰较小。
【数据】aspA过表达（RBS 4000 AU）产量：14.16 ± 0.35 g/L；aspA过表达（RBS 8000 AU）产量：13.47 ± 0.90 g/L；aspC过表达（RBS 2000 AU）产量：10.53 ± 0.20 g/L
进一步为减轻代谢负担并实现稳定表达，将aspA和aspC基因以不同RBS强度整合至基因组中。
图5显示了基因组整合aspA/aspC不同RBS强度对OSH产量的影响。基于质粒表达和基因组整合的结果，选择最佳组合进行后续研究。
【数据】基因组整合最佳产量：原文未详述（图5所示）
随后，对ASP-HS生物合成途径进行强化。
图6显示了增强ASP-HS生物合成途径对OSH产量的影响。通过上述逐步优化，L-高丝氨酸的供给得到显著增强。
【数据】强化ASP-HS途径后的OSH产量：原文未详述（图6所示）
3.3 平衡琥珀酰辅酶A的供给
L-高丝氨酸供给增强后，另一个核心前体琥珀酰辅酶A的供给平衡成为进一步限速因素。
图7显示了平衡琥珀酰辅酶A供给对OSH产量的影响。通过代谢调控策略平衡两个核心前体的供给效率，OSH产量得到进一步提升。
【数据】平衡琥珀酰辅酶A后的OSH产量：原文未详述（图7所示）
3.4 改善辅因子与ATP供给
在前期优化的基础上，对辅因子和能量代谢进行全局优化。
图8显示了改善辅因子和ATP供给对OSH产量的影响。图8A为不同菌株的发酵结果，图8B为相关菌株的NADPH含量，图8C为相关菌株的ATP含量。摇瓶发酵结果显示，最终工程菌株OSHM40的OSH产量达到20.15 ± 0.21 g/L。
【数据】OSHM40摇瓶产量：20.15 ± 0.21 g/L；NADPH含量：原文未详述（图8B）；ATP含量：原文未详述（图8C）
3.5 5-L生物反应器补料分批发酵
为评估工程菌株OSHM40的工业化应用潜力，在5-L生物反应器中进行了补料分批发酵。
图9显示了菌株OSHM40在5-L生物反应器中的补料分批发酵曲线。最终OSH产量达到104.09 ± 2.06 g/L，糖酸转化率为64.99%，体积生产率为1.43 g/L/h。
【数据】5-L发酵罐OSH产量：104.09 ± 2.06 g/L；糖酸转化率：64.99%；体积生产率：1.43 g/L/h
讨论与解读
本研究以实验室保藏的大肠杆菌W3110为起点，通过系统的代谢工程策略构建了高产OSH菌株OSHM40，包括减弱竞争途径、增强前体供给、平衡关键代谢路线、改善辅因子再生成和优化能量代谢。经上述改造后，摇瓶发酵OSH产量从7.82 ± 0.09 g/L提高至20.15 ± 0.21 g/L，5-L生物反应器补料分批发酵产量达104.09 ± 2.06 g/L，糖酸转化率64.99%，体积生产率1.43 g/L/h。产量和转化率均创下目前报道的无质粒大肠杆菌OSH生产菌株的新纪录。值得注意的是，本研究在增强前体合成和辅因子供给的基础上，采用动态调控策略平衡两种关键前体的合成效率，显著提升了目标产物产量。该工作为具有相似生物合成途径的化合物高产菌株构建提供了有价值的参考。
编译者解读： 本研究的一大亮点是全程采用无质粒系统——通过CRISPR/Cas9基因组整合与RBS精细调谐，避免了质粒带来的代谢负担和遗传不稳定性，这对工业放大具有重要意义。104 g/L的产量与65%的糖酸转化率在氨基酸类平台化学品中处于领先水平。值得注意的是，作者在副产物敲除策略中优先选择mgsA而非传统的ldhA，基于好氧条件下ldhA几乎不表达这一代谢调控认知，体现了对菌株生理状态的精准把握。不过，动态调控策略的具体机制描述在原文中着墨有限，其普适性仍有待在其他产物体系中验证。
参考来源
Huang S-min. Reconstruction and metabolic regulation of O-succinyl-L-homoserine biosynthesis pathway in Escherichia coli W3110. Journal of Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.08.013
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.08.013