来源：Substrate-informed metabolic engineering enables a genome-encoded seven-sugar chassis of Corynebacterium glutamicum for spent sulfite liquor valorization（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质纤维素和造纸工业副产物中的混合糖高效微生物转化，是工业生物技术长期面临的瓶颈。本研究以谷氨酸棒状杆菌为宿主，通过基因组整合方式逐步引入甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖利用模块，建立了稳定的七糖底盘菌株。研究不依赖适应性进化和高拷贝表达，而是将各糖利用途径的通量能力与天然摄取和中心代谢进行定量匹配。在真实亚硫酸盐废液（SSL）验证中，工程菌实现了全部可发酵糖的近完全消耗，并成功将废液转化为30 g L⁻¹戊二酸。
研究背景
可持续生物制造日益依赖可再生和废弃物来源的碳源。木质纤维素和造纸工业侧流因体量大、与粮食资源竞争低而备受关注，但其异质碳水化合物组成对微生物转化构成重大瓶颈。多数工业微生物偏好代谢有限的糖类底物，导致大量可用碳未被利用，制约了过程效率和经济性。亚硫酸盐废液是亚硫酸盐制浆过程的主要副产物，含葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖等己糖与戊糖的复杂混合物，同时含有机酸和抑制物。仅欧洲主要纸浆产区，SSL流每年就含超百万吨可发酵糖，但大部分可再生碳至今未被利用。近期，底物信息指导的代谢对齐策略已在谷氨酸棒状杆菌中实现葡萄糖-木糖的均衡共利用。本研究进一步考察该对齐原则能否扩展至更复杂的工业原料体系。
研究方法
2.1 菌株与质粒
谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032（DSM 20300）作为野生型背景。戊二酸生产菌株GTA-4（Rohles et al., 2018），源自ATCC 13032，用于途径构建和转化验证。大肠杆菌DH5α和NM522（Invitrogen, Karlsruhe, Germany）分别用于质粒扩增和甲基化（Kind et al., 2011）。所有菌株以甘油储备液保存于−80 °C。谷氨酸棒状杆菌的基因组修饰采用整合载体pClik int sacB（Becker et al., 2005）。转化谷氨酸棒状杆菌所需的DNA甲基化通过辅助质粒pTC实现（Kind et al., 2010）。在含甘露糖和木糖培养基上初步验证糖利用表型时，使用附加体质粒pVWEx1 manA和pEKEx3 xylA Xc xylB Cg（Meiswinkel et al., 2013; Perez-Garcia et al., 2021）。所有质粒均携带标准大肠杆菌复制起点和抗生素抗性标记。菌株和质粒完整列表见表2。
【数据】菌株：C. glutamicum ATCC 13032、GTA-4、E. coli DH5α/NM522；保存温度：−80°C；载体：pClik int sacB、pTC、pVWEx1 manA、pEKEx3 xylA Xc xylB Cg；抗性标记：原文未详述
2.2 分子设计与基因工程
遗传设计使用SnapGene（Insightful Science）构建。DNA片段通过高保真聚合酶和基因特异性克隆引物PCR扩增（补充表S1）。载体组装采用Gibson等温克隆法（Gibson et al., 2009）。重组质粒经限制性酶切分析和测序验证（GATC Biotech, Konstanz, Germany）。大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌转化遵循已建立方案（Weiland et al., 2025）。正确的染色体整合通过菌落PCR和测序确认。用于谷氨酸棒状杆菌异源表达的密码子优化基因序列见补充表S2。详细克隆步骤见补充方法。
【数据】PCR聚合酶：高保真（原文未详述具体品牌）；组装方法：Gibson等温克隆；验证方法：限制性酶切分析+测序+菌落PCR
2.3 限定培养基和SSL培养基中的摇瓶培养
摇瓶培养在250 mL带挡板摇瓶中进行，含25 mL培养基，30 °C、230 rpm。限定最低培养基成分（每升）：15 g (NH₄)₂SO₄、1 g NaCl、0.2 g MgSO₄·7H₂O、55 mg CaCl₂、20 mg FeSO₄、0.5 mg生物素、1 mg硫胺素·HCl、1 mg泛酸钙、30 mg 3,4-二羟基苯甲酸、100 mL缓冲储备液（2 M磷酸钾，pH 7.8）、10 mL微量元素储备液（200 mg L⁻¹ FeCl₃·6H₂O、200 mg L⁻¹ MnSO₄·H₂O、50 mg L⁻¹ ZnSO₄·7H₂O、20 mg L⁻¹ CuCl₂·2H₂O、20 mg L⁻¹ Na₂B₄O₇·10H₂O、10 mg L⁻¹ (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，pH 1.0）。单一糖（葡萄糖、甘露糖、木糖、L-阿拉伯糖、半乳糖、L-鼠李糖或果糖）作为唯一碳源，添加量10 g L⁻¹，用于底物利用能力的定性评估。此外，限定多糖混合物实验在含等摩尔浓度单糖的最低培养基中进行，每种糖添加量5 g L⁻¹。这些实验用于评估受控且成分明确条件下的同步底物利用。过程相关条件下的定量混合糖实验使用亚硫酸盐废液（SSL）培养基。SSL超滤透过液（SSL-UF）购自Borregaard（Sarpsborg, Norway），添加量为10–20%（v/v）。本研究所用SSL超滤透过液组成汇总于表3。SSL培养基每升补充：20 g (NH₄)₂SO₄、5 g尿素、1 g KH₂PO₄、1 g K₂HPO₄、0.25 g MgSO₄·7H₂O、42 g MOPS、10 mg CaCl₂、2 mg生物素、30 mg 3,4-二羟基苯甲酸和1 mL微量元素储备液（10 g L⁻¹ FeSO₄·7H₂O、10 g L⁻¹ MnSO₄·H₂O、1 g L⁻¹ ZnSO₄·7H₂O、200 mg L⁻¹ CuSO₄、20 mg L⁻¹ NiCl₂·6H₂O，pH 1.0）。携带质粒的菌株按需添加卡那霉素和壮观霉素（各50 μg mL⁻¹），适用时用1 mM IPTG诱导基因表达。预培养在脑心浸液（BHI）培养基中进行，转接至最低培养基后，以初始OD₆₆₀ = 1.0接种主培养。
【数据】培养容器：250 mL带挡板摇瓶；装液量：25 mL；温度：30°C；转速：230 rpm；单一糖浓度：10 g L⁻¹；混合糖浓度：各5 g L⁻¹；SSL-UF添加量：10–20%（v/v）；抗生素浓度：50 μg mL⁻¹各；IPTG：1 mM；初始OD₆₆₀：1.0
2.4 搅拌罐生物反应器中戊二酸的补料分批生产
补料分批发酵在1 L生物反应器（SR0700ODLS, DASGIP AG, Jülich, Germany）（Kohlstedt et al., 2025）中进行，初始体积300 mL SSL培养基，含10%（v/v）SSL透过液和5 g L⁻¹酵母提取物。过程在30 °C、pH 7.0 ± 0.1条件下运行，通过自动添加NaOH维持pH。溶解氧通过控制搅拌和通气保持于30%空气饱和度以上（初始800 rpm，18 sL h⁻¹）。SSL透过液作为唯一补料，维持恒定的10%补料比例。尾气组成（O₂、CO₂）在线监测，过程数据用DASware Control软件记录。
【数据】反应器：1 L（SR0700ODLS, DASGIP AG）；初始体积：300 mL；SSL浓度：10%（v/v）；酵母提取物：5 g L⁻¹；温度：30°C；pH：7.0 ± 0.1；溶氧：>30%空气饱和度；初始搅拌：800 rpm；通气：18 sL h⁻¹
2.5 分析方法
#### 2.5.1 糖、有机酸和生物量的定量
糖（葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖）通过HPLC（Agilent 1260 Infinity）定量，使用NUCLEOGEL Sugar Pb色谱柱（Macherey-Nagel, Düren, Germany），80 °C，超纯水为洗脱液，示差折光检测。有机酸（乙酸、乳酸、甲酸、乙酰丙酸和戊二酸）在Aminex HPX-87H色谱柱（Bio-Rad, Munich, Germany）上分析，3–12 mM H₂SO₄为洗脱液，45–60 °C（Rohles et al., 2022）。定量基于外标法。氨基酸通过邻苯二甲醛柱前衍生化，以α-氨基丁酸为内标，HPLC定量（Krömer et al., 2005）。细胞干重（CDM）由光密度计算：CDM [g L⁻¹] = 0.32 × OD₆₆₀（Rohles et al., 2016）。
【数据】HPLC色谱柱：NUCLEOGEL Sugar Pb（80°C，超纯水洗脱）；Aminex HPX-87H（3–12 mM H₂SO₄，45–60°C）；CDM换算系数：0.32 × OD₆₆₀
#### 2.5.2 碳水化合物的GC-MS分析
SSL和培养样品中的碳水化合物谱通过GC-MS分析，使用7890A GC系统连接5975C四极杆检测器（Agilent Technologies, Waldbronn, Germany）。样品制备和衍生化遵循已建立方案（Buschke et al., 2011; Kohlstedt and Wittmann, 2019）。简要步骤：干燥水解物在吡啶中甲氧肟化，随后用N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA）硅烷化。分离在HP-5ms毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）上进行，氦气为载气，流速1 mL min⁻¹。定量基于特征碎片离子和真实糖标准品校准。
【数据】GC-MS系统：7890A GC + 5975C检测器；色谱柱：HP-5ms（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；载气：氦气，1 mL min⁻¹；衍生化：甲氧肟化+BSTFA硅烷化
#### 2.5.3 靶向转录分析
定量RT-PCR作为靶向诊断工具，用于验证选定谷氨酸棒状杆菌菌株中异源糖利用基因的转录，方法如前所述（Sommer et al., 2026）。培养物在含相应测试糖的最低培养基中生长，于指数生长早期收获。细胞快速冷冻，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen, Venlo, Netherlands）提取总RNA。RNA完整性通过Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）确认，所有样品RNA完整性数值（RIN）均为10。从500 ng总RNA合成cDNA，使用Maxima First Strand cDNA Kit（Thermo Fisher Scientific）。定量PCR在QuantStudio 3系统（Thermo Fisher Scientific）上进行，使用PowerUp SYBR Green Master Mix和基因特异性引物（补充表S3）。转录水平归一化至参考基因sigA、Ncgl2772和eftu。这些分析用于确认导入模块的功能表达，并非用于解析调控机制或建立转录水平与代谢性能之间的定量关系。
【数据】RNA提取：RNeasy Mini Kit；RIN值：10；cDNA合成模板量：500 ng总RNA；qPCR系统：QuantStudio 3；参考基因：sigA、Ncgl2772、eftu
2.6 同位素示踪研究与GC-MS ¹³C标记分析
¹³C同位素示踪实验中，细胞首先在BHI培养基中培养，随后在含合成糖混合物（葡萄糖、甘露糖、木糖、L-阿拉伯糖、半乳糖、L-鼠李糖和果糖，各10 mM）的最低培养基中进行第二次预培养。主培养随后在七个独立的示踪实验中接种——原文此处截断。
【数据】示踪糖混合物：7种糖各10 mM；预培养步骤：BHI→合成糖混合物最低培养基；主培养：7个独立示踪实验（后续细节原文未完整呈现）
研究结果
3.1 野生型谷氨酸棒状杆菌在SSL相关糖和复杂SSL底物上生长有限
为评估底物信息指导的代谢对齐能否扩展至工业底物复杂性，我们首先确立了野生型谷氨酸棒状杆菌在亚硫酸盐废液超滤透过液（SSL-UF）上的生理基线。SSL-UF含六种主要可发酵糖——葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖——代表化学异质且动力学上具挑战性的碳源（图1A）。代表性SSL-UF样品如图1B所示。野生型在SSL-UF上的生长揭示了显著的底物层级性和不完全碳利用（图1C），凸显了天然代谢能力与原料复杂性之间的不匹配。单一糖和限定糖混合物的详细生长曲线见补充信息（图S1–S7），证实了戊糖和脱氧己糖天然利用途径的缺失以及甘露糖同化的动力学低效性。该基线表型定义了系统化基因组编码底物谱扩展的参考状态。
【数据】SSL-UF主要可发酵糖：6种（葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖）；野生型生长：底物层级性明显、碳利用不完全
3.2 基于质粒的甘露糖和木糖利用扩展支持生长，但不足以实现高效SSL转化
作为底物谱扩展的初始步骤，将甘露糖和木糖利用的质粒表达模块引入ATCC 13032背景。甘露糖和木糖是SSL中含量最丰富的非葡萄糖糖类，其同化是改善多糖转化的先决条件。所得菌株ALL-1携带附加型构建体，能够过表达天然甘露糖异构酶（manA）和异源木糖异构酶-木酮糖激酶途径。在单一底物上，质粒表达消除了甘露糖相关的延迟期，并实现了在木糖上的稳健生长（补充图S1），确认了功能性途径安装。然而，这一改善并未转化为复杂SSL底物的高效转化。在SSL-UF培养中，ALL-1比野生型形成更多生物量（图1D），表明碳可及性扩大，但糖利用在动力学上仍不协调。葡萄糖被优先消耗，尽管甘露糖和木糖摄取可检测到，但转化缓慢且多种非葡萄糖糖的转化不完全。此外，质粒菌株在SSL上表现出明显延迟期并延长了总体培养时间，这对过程应用而言是不期望的特征。因此，虽然附加型表达使额外底物上的生长成为可能，但在原料复杂性条件下未能建立均衡稳健的多糖利用。这些局限表明，仅途径存在是不够的，促使研究转向稳定的基因组编码实施与定量代谢对齐相结合的策略。
【数据】菌株：ALL-1（质粒表达manA + 异源木糖异构酶-木酮糖激酶）；SSL-UF培养：生物量高于野生型，但非葡萄糖糖转化不完全且存在明显延迟期
3.3 基因组编码的甘露糖和木糖途径消除质粒相关局限并建立稳定底盘
为克服附加型表达相关的动力学不稳定性和延长培养时间，糖利用功能被直接整合至谷氨酸棒状杆菌染色体中，建立了基因组编码底盘。整合遵循先前确立的底物信息指导的代谢对齐原则——将途径能力与摄取通量和中心代谢连接性匹配，而非最大化表达强度。作为初始步骤，通过天然manA基因的组成型过表达增强甘露糖利用。所得菌株ALL-2相比质粒菌株表现出更快的生长、更高的甘露糖摄取率和更好的可重复性（补充图S1），证实了染色体实施对稳定性的改善效应。在此背景上，通过基因组整合异源木糖异构酶模块建立木糖利用。选择野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）的木糖异构酶模块作为起点，因其先前已在谷氨酸棒状杆菌中成功建立，且可从我们早期葡萄糖-木糖共利用工作中获取（Mees et al., 2026）。评估了三种变体（ALL-3A、ALL-3B、ALL-3C）。仅携带野油菜黄单胞菌天然xylA基因的菌株ALL-3B支持在木糖上的可重复生长，而密码子优化构建体未能实现（图2A；补充图S2）。ALL-3B相比质粒菌株和替代染色体设计，兼具加速生长和更高木糖摄取率（表4）。在限定糖混合物中，ALL-3B相比其质粒对应菌株表现出更快的早期生长和更协调的甘露糖-木糖利用（图2B），表明动力学整合得到改善。在SSL条件下，基因组表达使生长在约20小时内完成，而质粒菌株需要60小时（图2C）。综上，这些结果表明染色体实施将底物可及性转化为动力学稳定且适用于原料的性能，确立ALL-3B作为进一步底盘扩展的稳健甘露糖-木糖平台。
【数据】菌株：ALL-2（manA组成型过表达）、ALL-3A/B/C（木糖异构酶变体）；ALL-3B：携带X. campestris天然xylA；SSL培养完成时间：约20 h（基因组）vs 60 h（质粒）；木糖摄取率：见表4（原文未在节选给出具体数值）
3.4 基因组基础的L-阿拉伯糖利用实施扩展戊糖覆盖
为进一步扩展戊糖利用，将基因组编码的L-阿拉伯糖代谢引入工程底盘。野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032无法在L-阿拉伯糖上生长（补充图S3），反映其缺乏天然阿拉伯糖分解途径。相比之下，谷氨酸棒状杆菌ATCC 31831含有完整的阿拉伯糖利用操纵子（Kawaguchi et al., 2009），被选为遗传兼容性设计框架以最小化宿主-途径不相容性。基于该架构的多种操纵子构型被构建并整合至甘露糖-木糖菌株ALL-3B中。依据先前报道——iolR的破坏可缓解戊糖代谢的调控限制并提供合适的整合位点（Meiswinkel et al., 2013; Sasaki et al., 2009）——所有阿拉伯糖操纵子均插入iolR位点。评估了三种设计。两种变体支持在L-阿拉伯糖上的生长，一种失败（图2D；补充图S3）。携带谷氨酸棒状杆菌ATCC 31831天然araBDAE操纵子的菌株ALL-4C表现出最优表型，最大比生长速率达0.17 h⁻¹，约为替代构建体的两倍——被选作进一步扩展对象（表4）。在递增的底物复杂性下，阿拉伯糖模块在限定四糖混合物（图2E）和含20%（v/v）SSL-UF的培养基（图2F）中均保持功能，展示了与逐步底物谱扩展的兼容性。尽管总体生长动力学相比甘露糖-木糖背景略有降低，阿拉伯糖同化得以维持。值得注意的是，在此阶段尚无专用半乳糖途径的情况下，混合底物条件下检测到低水平半乳糖消耗，表明网络扩展过程中出现了交叉底物相互作用。
【数据】菌株：ALL-4C（araBDAE操纵子，整合于iolR位点）；最大比生长速率：0.17 h⁻¹（约为替代构型的2倍）；SSL-UF浓度：20%（v/v）；阿拉伯糖模块在四糖混合物和SSL中均保持功能
3.5 基因组基础的半乳糖利用实施使主要SSL己糖可及
为进一步将底物谱扩展至SSL来源的主要己糖，将基因组编码的半乳糖利用引入工程底盘。与通过天然磷酸转移酶系统进入中心代谢的甘露糖不同，半乳糖需要专用的Leloir途径才能转化为糖酵解中间体。因此选择天然基因Leloir架构以促进平衡化学计量和稳定途径整合。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的galPMKTEL操纵子代表完整的Leloir途径——原文此处截断。
【数据】半乳糖途径来源：L. lactis galPMKTEL操纵子（完整Leloir途径）；后续数据原文未完整呈现
讨论与解读
本研究将底物信息指导的代谢工程从限定混合糖系统扩展至化学复杂的工业原料。通过逐步、基因组基础的扩展以及糖摄取和同化途径的定量对齐，在谷氨酸棒状杆菌中建立了七糖利用底盘，实现了亚硫酸盐废液的高效转化（图8）。多糖SSL系统在此作为边界案例，用于评估底层工程策略是否构成可扩展的底盘工程原理，而非原料或糖特异性的解决方案。定量协调摄取与途径能力支持了在递增底物复杂性下的稳健多糖代谢；设计选择决定了表型稳定性；这些原理可进一步转化至产物合成和未来底盘开发。多数已建立的生产宿主表现出显著底物层级性，强制顺序糖利用，这通常由碳分解代谢物阻遏及相关全局调控机制介导。这些调控特征在细菌和酵母中已被充分表征，构成工业混合糖转化的根本障碍。
【数据】七糖底盘：基因组编码；验证底物：SSL（含6种主要可发酵糖）；戊二酸产量：30 g L⁻¹（补料分批）；转化时间：约20 h（基因组菌株）
编译者解读
本研究的方法论核心在于"定量对齐"而非"过表达驱动"——将各糖利用途径的通量能力与菌株天然摄取速率和中心代谢容量匹配，这种思路跳出了传统底盘构建中"基因越多越好"的惯性。从应用角度看，直接在基因组上整合七套糖利用模块并保持转录稳定性，避免了质粒系统和诱导剂带来的工艺负担。以SSL这种真实工业废液作为验证底物而非仅停留在合成糖混合物，也增强了成果的产业转化说服力。30 g L⁻¹戊二酸的产量证明多底物底盘与产物的适配性。值得关注的是，部分糖利用模块（如密码子优化的木糖异构酶构建体）失效而天然序列成功，提示合成生物学中"优化"并不总是最优解——这提醒我们在途径设计时需更尊重宿主内源调控语境。
参考来源
Cao, P. Substrate-informed metabolic engineering enables a genome-encoded seven-sugar chassis of Corynebacterium glutamicum for spent sulfite liquor valorization. Metabolic Engineering, 2026.
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102503
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102503