来源：Effects of natural storage on polyphenol composition and biosynthesis in rice（LWT）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
水稻贮藏品质劣变与多酚类生物活性物质的变化密切相关。本研究以三个不同亚种的水稻品种为材料，系统考察了12个月自然贮藏对籽粒多酚组成、抗氧化活性及生物合成途径的影响。研究发现，贮藏后水稻总酚含量显著增加，其中酚酸类代谢物在三个品种中呈现一致的累积上调趋势。代谢组学共鉴定出565种多酚代谢物，山柰素、二氢双去甲氧基姜黄素等四种多酚被提出作为贮藏品质变化的潜在标志物。苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟化酶等关键酶活性的显著升高，从生化层面揭示了贮藏期间多酚生物合成被激活的分子证据。
研究背景
水稻是全球半数以上人口的主粮，提供约25%的日常热量需求。1961年至2023年间，全球水稻产量从2.15亿吨增至8亿吨，其中中国的产量从5360万吨大幅增至2.066亿吨，为全球粮食安全作出了重要贡献。由于水稻收获的季节性与消费的连续性之间存在矛盾，收获后水稻通常需要经历较长的贮藏期。贮藏期间，大米的口感、糊化特性、蒸煮品质、风味及营养性质会因其营养成分组成、结构和性质的改变以及微生物群落的演替而变差。尽管淀粉、蛋白质和脂质等主要常量营养素在贮藏期间的变化已被广泛研究，但生物活性化合物的变化受到的关注相对较少。多酚是水稻籽粒中的一大类生物活性化合物，包括类黄酮、酚酸、芪类、木脂素和鞣质等，具有多种促进健康的功能。其中酚酸和类黄酮是含量最丰富的多酚类群。
研究方法
2.1 水稻材料与贮藏处理
常规粳稻品种南京9108（NJ9108）、籼稻品种黄华占（HHZ）和籼型杂交稻品种晶两优1212（JLY1212）种植于长沙的稻田中（28°11′N，112°58′E）。2023年9月收获的新鲜稻谷在35°C下干燥至含水量13%–14%。每个品种取500克干燥稻谷，装入1升玻璃容器中，用透气膜密封。样品在培养箱内、避光自然条件下贮藏，时间为2023年10月至2024年9月（12个月）。贮藏期间的平均温度和相对湿度分别为19°C和49%。每个品种的新鲜和贮藏稻米样品均来自三个独立的玻璃容器，并在−80°C下冷冻保存以供后续分析。
【数据】品种：NJ9108（粳稻）、HHZ（籼稻）、JLY1212（籼型杂交稻）；样品量：500 g/容器；容器：1 L玻璃容器；贮藏条件：自然条件避光，19°C，相对湿度49%；贮藏时间：12个月（2023.10–2024.09）；干燥条件：35°C至含水量13%–14%；生物学重复：3个独立容器
2.2 稻米样品的色泽评估
新鲜和贮藏稻谷使用小型碾米机加工成糙米和精米。用数码相机记录糙米和精米的外观。使用便携式色差仪（CS-580，CHN Spec，中国）对精米的颜色参数进行量化。测量采用五个生物学重复，每个重复使用50粒米。总色差ΔE按照先前建立的方法计算（Zeng et al., 2025）。
【数据】仪器：CS-580便携式色差仪；生物学重复：5个；每重复用米量：50粒；指标：L、a、b*、ΔE
2.3 总酚含量及抗氧化活性的测定
总酚提取采用先前建立的方案并略作修改（Chu et al., 2020; Zhou et al., 2014）。将新鲜和贮藏糙米磨成粉末并过100目筛。取100 mg米粉，加入2.5 mL 80%（v/v）甲醇，在60°C下超声提取30 min。超声处理功率为300 W，开启时间5 s、间隔时间8 s。在13,800×g、4°C条件下离心10 min收集上清液，经0.22 μm滤膜过滤，得到游离酚组分。剩余沉淀用5 mL 4 M NaOH溶液重悬，在30°C、250 rpm振荡条件下水解4 h。离心（13,800×g，4°C，10 min）收集上清液，用HCl调至pH 1.5。用25 mL乙酸乙酯萃取酚类物质。乙酸乙酯萃取液在35°C下用旋转蒸发仪蒸干。干燥粉末溶于2.5 mL 80%（v/v）甲醇中，经0.22 μm滤膜过滤，得到结合酚组分。总酚含量为游离酚提取物与结合酚提取物之和。使用植物总酚测定试剂盒（BC1340，Solarbio，中国）按制造商说明书测定总酚含量，以没食子酸作为定量标准。抗氧化活性采用总抗氧化能力测定试剂盒（ABTS法，S0119，Beyotime，中国）和DPPH自由基清除能力测定试剂盒（AKAO020M，boxbio，中国）按各自说明书进行测定。
【数据】样品量：100 mg米粉；提取溶剂：80%甲醇2.5 mL；超声条件：60°C、300 W、5 s开/8 s停、30 min；离心：13,800×g、4°C、10 min；滤膜：0.22 μm；碱水解：5 mL 4 M NaOH、30°C、250 rpm、4 h；酸化pH：1.5；萃取溶剂：乙酸乙酯25 mL；旋蒸温度：35°C；定量标准：没食子酸
2.4 多酚代谢组学分析
#### 2.4.1 多酚提取
糙米样品用冷冻干燥机（Scientz-100 F，中国）冻干63 h，然后用组织研磨机（MM 400，Retsch，德国）在30 Hz下研磨1.5 min。取50 mg米粉与1.2 mL预冷的70%（v/v）甲醇水溶液混合。样品在冰水浴中超声处理15 min，然后在4°C摇床上过夜提取。在13,800×g、4°C条件下离心10 min后，将所得上清液通过0.22 μm微孔滤膜（SCAA-104，ANPEL，中国）过滤，转移至进样瓶中，用于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析。
【数据】冻干时间：63 h；研磨条件：30 Hz、1.5 min；样品量：50 mg；提取溶剂：预冷70%甲醇1.2 mL；超声：冰水浴15 min；提取：4°C过夜；离心：13,800×g、4°C、10 min；滤膜：0.22 μm
#### 2.4.2 UPLC条件
多酚提取物使用UPLC-ESI-MS/MS系统（UPLC：ExionLC™ AD，SCIEX，新加坡；MS：Q TRAP 4500，SCIEX，新加坡）进行分析。色谱分离在Agilent SB-C18色谱柱（1.8 μm，2.1 mm × 100 mm）上进行。流动相由溶剂A（含0.1%甲酸的纯水）和溶剂B（含0.1%甲酸的乙腈）组成。分析采用线性梯度洗脱程序：起始条件为95% A和5% B，在9 min内线性升至5% A和95% B并保持1 min。随后在1.1 min内线性恢复至初始条件（95% A和5% B）并保持2.9 min。流速设为0.35 mL/min。柱温箱温度设为40°C。进样量为2 μL。流出液导入ESI-三重四极杆-线性离子阱（Q TRAP）-MS。
【数据】色谱柱：Agilent SB-C18（1.8 μm，2.1 mm × 100 mm）；流动相A：0.1%甲酸水；流动相B：0.1%甲酸乙腈；梯度：95% A→5% A（9 min线性），保持1 min，1.1 min回至初始，保持2.9 min；流速：0.35 mL/min；柱温：40°C；进样量：2 μL
#### 2.4.3 ESI-Q TRAP-MS/MS
线性离子阱和QqQ扫描在配备ESI Turbo Ion-Spray接口的Q TRAP-MS上采集，在正离子模式下运行，由Analyst 1.6.3软件（AB Sciex，Framingham，美国）控制。ESI源操作参数如下：源温度500°C；离子喷雾电压5500 V（正离子模式）/−4500 V（负离子模式）；离子源气体I、气体II和帘气分别设为50、60和25 psi；碰撞活化解离设为高。QQQ扫描在多反应监测（MRM）模式下进行，以氮气为碰撞气体，压力为5 psi。每个MRM跃迁的去簇电压和碰撞能量分别进行优化。根据各时间段内洗脱的代谢物，监测相应的一组MRM跃迁。MS1和MS2数据的定性分析按照先前描述的方法进行（Chen et al., 2013）。
【数据】源温度：500°C；离子喷雾电压：5500 V（正离子）/−4500 V（负离子）；气体I/II/帘气：50/60/25 psi；碰撞气：N₂，5 psi；模式：MRM
#### 2.4.4 差异多酚代谢物的筛选
差异代谢物通过多变量和单变量统计方法共同鉴定。多变量分析包括主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。在OPLS-DA建模前，数据经过对数变换（log2）和均值中心化处理。VIP值通过R包MetaboAnalystR从OPLS-DA模型获得。VIP > 1的代谢物被视为差异代谢物。单变量分析包括假设检验和差异倍数（FC）分析。贮藏米与新鲜米之间满足|log2FC| ≥ 1或P < 0.05的代谢物被视为差异累积代谢物。在本研究中，差异多酚代谢物定义为同时满足以下两个标准的代谢物：VIP > 1且|log2FC| ≥ 1。差异代谢物使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行注释和分类（Kanehisa et al., 2015）。
【数据】筛选标准：VIP > 1且|log2FC| ≥ 1；数据预处理：log2变换+均值中心化
2.5 酶活性测定
苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、查尔酮异构酶（CHI）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）和多酚氧化酶（PPO）的活性使用商业比色法试剂盒（AKAM012M、AKSU056M、AKPL028M，Boxbio，中国；BC4225、BC0195，Solarbio，中国）测定。粗酶提取物由5粒米加1 mL提取缓冲液（试剂盒提供）制备。上清液在13,800×g、4°C条件下离心10 min收集，然后按照制造商说明书进行酶活性测定。粗提物中的总蛋白浓度使用BCA蛋白测定试剂盒（ECOTOP，EK-5001，中国）定量。酶活性表示为每毫克蛋白的U数。查尔酮合酶（CHS）和黄烷酮-3-羟化酶（F3H）的活性使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（YJ134952，YJ134952，mlbio，中国）进行定量。粗酶提取物由5粒米加1 mL提取缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl₂，1 mM乙二胺四乙酸，2 mM二硫苏糖醇）制备。
【数据】酶：PAL、C4H、CHI、4CL、PPO（比色法试剂盒）；CHS、F3H（ELISA试剂盒）；粗酶制备：5粒米+1 mL提取缓冲液；离心：13,800×g、4°C、10 min；蛋白定量：BCA法；酶活单位：U/mg蛋白；提取缓冲液成分：100 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM MgCl₂、1 mM EDTA、2 mM DTT
研究结果
3.1 新鲜与贮藏稻米的色泽特征
籽粒颜色是长期贮藏后稻米品质的关键指标。三个品种在自然贮藏前后糙米和精米的视觉外观如图1A所示。所有新鲜糙米呈现均匀的浅棕色，而精米呈白色。经过12个月的自然贮藏后，HHZ和JLY1212的糙米和精米均表现出明显的暗沉，部分籽粒出现深灰色。相比之下，NJ9108仅表现出轻微的变色。进一步采用比色分析量化精米的颜色差异。与新鲜米相比，贮藏米的L值显著降低（图1B），同时a和b*值显著升高（图1C和D），表明籽粒整体变暗且颜色向红色和黄色偏移。值得注意的是，HHZ和JLY1212的总色差（ΔE）显著高于NJ9108（图1E）。这些结果表明，自然贮藏会导致稻米籽粒黄化和褐变，其中籼稻品种的变色程度较粳稻品种更为严重。
【数据】L：贮藏后显著降低；a、b*：贮藏后显著升高；ΔE：HHZ和JLY1212显著高于NJ9108；贮藏时间：12个月
3.2 新鲜与贮藏稻米的总酚含量及抗氧化活性
多酚是稻米籽粒中的主要抗氧化物质，与营养品质和贮藏稳定性密切相关。经12个月自然贮藏后，所有稻米样品的总酚含量均显著增加。具体而言，NJ9108、HHZ和JLY1212分别增加了26.1%、28.7%和27.3%（图1F）。使用ABTS和DPPH法测定了多酚提取物的抗氧化活性（图1G和H）。三个品种均表现出增强的自由基清除活性，与总酚含量的增加一致。
【数据】总酚增幅：NJ9108 +26.1%、HHZ +28.7%、JLY1212 +27.3%；ABTS和DPPH自由基清除活性：三个品种均增强
3.3 新鲜与贮藏稻米的多酚代谢组学分析
为研究稻米自然贮藏期间多酚代谢物的变化规律，采用多酚代谢组学方法对新鲜和贮藏稻米籽粒中的多酚代谢物进行全面鉴定。共检测到565种多酚代谢物，包括317种类黄酮（56.11%；其中黄酮171种、黄酮醇51种、黄烷酮23种、异黄酮21种、查尔酮14种、黄烷醇11种、双黄酮2种、黄烷酮醇2种、橙酮1种、花青素3种、其他类黄酮18种）、172种酚酸（30.44%）、21种木脂素（3.72%）、53种香豆素（9.38%）和2种鞣质（0.35%）（图2A）。比较分析显示品种间存在大量共有代谢物：NJ9108与HHZ共有493种，NJ9108与JLY1212共有493种，HHZ与JLY1212共有536种，三个品种共有的代谢物为486种（图2B）。这些结果表明，所检水稻品种间的多酚组成具有广泛的保守性。
PCA分析用于评估新鲜与贮藏稻米之间多酚组成的差异。主成分1（PC1）和主成分2（PC2）分别占总方差的30.48%和19.69%。所有18个稻米样品沿这两个主成分被清晰分为不同的组群，表明品种特性和贮藏处理均对多酚组成有影响（图2C）。三个水稻品种间的多酚代谢物丰度存在显著差异，贮藏米与新鲜米相比表现出明显的变化（图2D）。在多酚类别中，类黄酮和酚酸在12个月自然贮藏后变化最为显著，其中大多数酚酸呈现累积增加的趋势（图2E–G）。这些结果表明，稻米在自然贮藏过程中多酚代谢谱发生显著变化，且不同水稻品种间的变化趋势相似。
【数据】总鉴定多酚代谢物：565种（类黄酮317种占56.11%、酚酸172种占30.44%、木脂素21种占3.72%、香豆素53种占9.38%、鞣质2种占0.35%）；品种间共有：NJ9108/HHZ 493种、NJ9108/JLY1212 493种、HHZ/JLY1212 536种、三品种共有486种；PC1=30.48%、PC2=19.69%；样品数：18个
3.4 新鲜与贮藏稻米之间的差异多酚代谢物
为鉴定新鲜与贮藏稻米之间差异累积的多酚代谢物，采用OPLS-DA模型对多酚代谢物浓度进行配对比较。在所有比较组中，包括NJ9108组（NJ9108-12_vs_NJ9108-0）、HHZ组（HHZ-12_vs_HHZ-0）和JLY1212组（JLY1212-12_vs_JLY1212-0），OPLS-DA得分图均显示新鲜与贮藏稻米样品之间的清晰分离。排列检验证实了模型的稳健性，所有比较的Q2值均超过0.5，P值低于0.05。这些结果表明OPLS-DA模型对于后续差异累积多酚代谢物的鉴定是有效且可靠的。
基于OPLS-DA结果，以|log2FC| ≥ 1（上调FC ≥ 2；下调FC ≤ 0.5）和VIP > 1的双重标准筛选差异多酚代谢物。在NJ9108、HHZ和JLY1212比较组中，分别鉴定出59种（33种上调、26种下调）、85种（66种上调、19种下调）和76种（32种上调、44种下调）差异累积多酚代谢物（图3A–C）。在所有比较组中，类黄酮和酚酸构成差异多酚代谢物的主要类别。差异类黄酮的调控模式在不同品种间存在显著差异（NJ9108：14种上调、20种下调；HHZ：25种上调、11种下调；JLY1212：8种上调、42种下调）。相比之下，酚酸呈现更为一致的调控趋势，三个品种中超过80%的酚酸在贮藏米中显著上调（NJ9108：15种上调、4种下调；HHZ：31种上调、6种下调；JLY1212：22种上调、2种下调）。
韦恩图分析显示，三个水稻品种共有8种共同的差异多酚代谢物（图3D），包括3种酚酸和5种类黄酮（图3E）。其中，酚酸类代谢物乙酰氧基-[6]-姜辣素甲酯、二氢双去甲氧基姜黄素和甲基-6-姜酚，以及类黄酮代谢物山柰素，在三个水稻品种的贮藏米中均显著上调（|log2FC| ≥ 1，VIP > 1，P < 0.05）。因此，这些多酚代谢物可能作为指示稻米贮藏品质变化的潜在标志化合物。
【数据】差异代谢物数：NJ9108组59种（33上调/26下调）、HHZ组85种（66上调/19下调）、JLY1212组76种（32上调/44下调）；差异类黄酮：NJ9108 14上调/20下调、HHZ 25上调/11下调、JLY1212 8上调/42下调；差异酚酸：NJ9108 15上调/4下调、HHZ 31上调/6下调、JLY1212 22上调/2下调（>80%上调）；共有差异代谢物：8种（3种酚酸+5种类黄酮）；筛选标准：|log2FC| ≥ 1、VIP > 1、P < 0.05；模型验证：Q2 > 0.5，P < 0.05
3.5 差异多酚代谢物的累积模式
采用K-means聚类分析阐明差异多酚代谢物的累积趋势。三个水稻品种中共鉴定的156种差异多酚代谢物被分为六个亚类（图4A）。值得注意的是，亚类2和亚类4中的差异多酚代谢物在所有品种中表现出高度一致的贮藏诱导变化，而亚类1、3、5和6中的代谢物在不同品种间呈现分歧趋势（图4A）。在亚类2的27种差异多酚代谢物中，24种在三个品种中一致上调，包括4种类黄酮、15种酚酸、4种香豆素和1种木脂素（图4B）。类似地，亚类4的22种差异多酚代谢物中有20种在三个品种中一致上调，包括2种类黄酮、16种酚酸、1种香豆素和1种木脂素（图4B）。总体而言，这44种多酚代谢物在自然贮藏期间呈现普遍增加的趋势，其中酚酸占上调化合物的70%以上。
【数据】总差异代谢物：156种，分为6个亚类；亚类2：27种中24种一致上调（4类黄酮+15酚酸+4香豆素+1木脂素）；亚类4：22种中20种一致上调（2类黄酮+16酚酸+1香豆素+1木脂素）；酚酸占上调化合物的比例：>70%
3.6 新鲜与贮藏稻米之间多酚代谢的差异
为研究新鲜与贮藏稻米之间多酚生物合成的差异，对156种差异多酚代谢物进行了KEGG富集分析（图5A–C）。黄酮和黄酮醇生物合成、酪氨酸代谢和类黄酮生物合成等代谢通路在各比较组中均被富集。
进一步通过测定多酚生物合成途径中关键酶的活性来验证贮藏对多酚代谢的影响。多酚生物合成途径的核心步骤如图6A所示。与新鲜稻米相比，贮藏稻米中PAL、C4H、4CL和F3H的酶活性显著升高（图6B–D、G），而CHS和CHI的活性在新鲜和贮藏稻米之间无显著差异（图6E和F）。
【数据】富集通路：黄酮和黄酮醇生物合成、酪氨酸代谢、类黄酮生物合成；PAL、C4H、4CL、F3H活性：贮藏后显著升高；CHS、CHI活性：无显著差异
讨论与解读
多酚是稻米籽粒中的一大类生物活性植物化学物质，主要由酚酸和类黄酮组成。糙米的许多促进健康的作用与其多酚含量有关。本研究中，经过12个月的自然贮藏，稻米籽粒的总酚含量显著增加（图1F），并伴随抗氧化能力的增强（图1G和H）。这些发现与此前报道的40°C贮藏5个月期间总黄酮含量和抗氧化活性逐渐增加的现象一致。因此，这些贮藏稻米的多酚含量显著高于新鲜稻米，可能作为功能性食品中富含多酚的原料来源。
此前有研究报告糙米在不同恒温贮藏期间游离酚含量增加，但伴随结合酚含量的下降。游离酚含量的上升被归因于与细胞壁成分酯化或醚化的结合酚的水解。相比之下，有色稻米在37°C贮藏6个月后观察到酚含量下降，可能是酚类的热降解和/或在氧化反应中的消耗所致。与受控恒温条件不同，本研究采用的自然贮藏条件包含温度波动和光照变化等因素，这些环境因子可能以不同方式影响多酚的代谢动态。
多酚生物合成途径在稻米自然贮藏期间被上调，贮藏稻米中PAL、C4H、4CL和F3H活性的显著升高为此提供了直接证据。这一发现提示，稻米在贮藏期间并非被动地发生成分劣变，其自身的代谢活动可能仍在持续运作并主动重塑次生代谢物谱。
【编译者解读】该研究将代谢组学与酶活性测定相结合，从"产物—通路—酶"三个层面系统揭示了自然贮藏激活水稻多酚生物合成的现象。选择三个不同亚种的品种进行平行比较，增强了结论的普适性。值得注意的是，酚酸类物质在不同品种间呈现高度一致的上调趋势，而类黄酮则表现出品种特异性，这一差异暗示二者的调控机制可能不同。将山柰素等四种多酚列为贮藏标志物，为稻米品质监测提供了可操作的指标。局限在于仅测定了七个关键酶的活性，尚未深入到基因表达和转录调控层面。从应用角度看，适度贮藏可能成为提升糙米多酚含量的低成本策略，但需权衡其他品质指标的劣变程度。
参考来源
Yan T. Effects of natural storage on polyphenol composition and biosynthesis in rice. LWT, 2026. DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119886
DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119886