来源：Pichia pastoris Protein Disulfide Isomerase (PDI1) promoter for heterologous protein production and its sequence characterization（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
毕赤酵母（Pichia pastoris）是异源蛋白生产的王牌宿主，但强启动子驱动的多拷贝表达常引发未折叠蛋白反应（UPR），反而拖累产量。本研究系统解析了内质网分子伴侣PDI1基因的启动子区域，发现其序列中含有UPR响应元件（UPRE）与甲醇调控因子Mxr1的结合位点，并构建了由PDI1启动子驱动脂肪酶CalB表达的报告系统。结果表明，PDI1启动子虽转录强度弱于AOX1和GAP启动子，但在高拷贝数下可被UPR诱导激活，为精细调控异源蛋白表达提供了新选择。
研究背景
毕赤酵母作为甲基营养型酵母，能以无机盐培养基达到极高细胞密度，并具备糖基化、二硫键形成等真核蛋白加工能力，加之自身分泌蛋白极少，外源蛋白易于纯化，因而成为异源蛋白生产的明星宿主。优化该系统的生产力是近年研究热点，常用策略包括利用强启动子提高转录效率，以及优化发酵条件。AOX1启动子（甲醇诱导型）和GAP启动子（组成型）是使用最频繁的两个启动子。此外，甲醇利用通路的FLD1启动子可由甲醇或甲胺诱导，过氧化物酶体膜蛋白PEX8启动子受甲醇和油酸双重诱导，异柠檬酸裂解酶ICL1启动子则被乙醇激活。
PDI1编码蛋白质二硫键异构酶，是内质网中的主要蛋白之一，作为分子伴侣参与新生肽链二硫键的形成、修复与异构化。在多拷贝克隆中过表达PDI1等分子伴侣基因是缓解UPR的策略之一，但这种做法并非通用方案，往往具有蛋白特异性。深入理解PDI1启动子区域，可为更好地调控UPR提供线索。本研究旨在表征PDI1基因启动子区，并以Candida antarctica脂肪酶B（CalB）为报告蛋白，评估该启动子在不同碳源下与AOX1、GAP启动子的表达效率差异。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
P. pastoris X33（Invitrogen，美国）作为酵母表达宿主，E. coli TOP10作为载体构建宿主。重组大肠杆菌在低盐LB培养基（1%胰蛋白胨、0.5%蛋白胨、0.5%氯化钠）中于37°C、200 rpm条件下培养。P. pastoris X33在YPD/YPG培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖/1%甘油）中于28°C、200 rpm条件下培养。
【数据】大肠杆菌培养基：低盐LB（1%胰蛋白胨、0.5%蛋白胨、0.5%氯化钠）；温度：37°C；转速：200 rpm。毕赤酵母培养基：YPD/YPG（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖/1%甘油）；温度：28°C；转速：200 rpm。
2.2 启动子克隆与载体构建
本实验室前期构建的含有Candida antarctica脂肪酶B（nsB CalB）基因及其天然分泌信号肽的重组pPICZB载体作为报告蛋白来源。从KEGG基因组数据库获取PDI1（PAS_chr4_0844）启动子序列（起始密码子ATG上游1000 bp），以P. pastoris X33基因组DNA为模板进行PCR扩增（本研究所用引物序列列于表1）。以Invitrogen的pPICZB载体为骨架构建重组载体。用合适的限制性酶切位点BglII和EcoRI（见表1）将AOX1启动子替换为PDI1和GAP启动子。3′AOX DNA片段从pPIC3.5k载体扩增，插入载体的PciI位点，便于载体在EcoNI位点线性化（图1）。
【数据】启动子长度：ATG上游1000 bp；限制性酶切位点：BglII、EcoRI、PciI、EcoNI；模板：X33基因组DNA。
2.3 毕赤酵母转化
经验证和扩增后，重组质粒pPDI1–nsBCalB-3′AOX、pAOX-nsBCalB-3′AOX和pGAP-nsBCalB-3′AOX经EcoNI限制性内切酶线性化，通过电穿孔转化进入X33宿主。取10–15 μg线性化DNA，在1500 V、250 Ω电阻、50 μF电容条件下电穿孔（BTX电穿孔仪，美国）。3天后，含有100 μg/mL和500 μg/mL zeocin的YPD琼脂平板上出现菌落。用启动子和基因特异性引物通过PCR确认重组毕赤克隆的报告基因整合。用于电穿孔的线性DNA量影响毕赤酵母转化结果，高浓度DNA（15–20 μg）可提高多拷贝整合几率。
【数据】线性化DNA用量：10–15 μg；电穿孔参数：1500 V、250 Ω、50 μF；zeocin浓度：100 μg/mL和500 μg/mL；菌落出现时间：3天；高浓度DNA：15–20 μg。
2.4 定量实时PCR（qPCR）分析
为估算基因拷贝数，从阳性克隆中分离基因组DNA，取4 ng DNA作为qPCR模板。以X33基因组DNA为单拷贝参照进行 comparative quantification，Arg4为看家基因，3′AOX为目标基因（参照Zhang et al., 2010）。基因表达分析中，从预培养至OD 600 nm为2–6的pPDI–nsBCalB-3′AOX菌株中提取RNA，用无菌水洗涤三次。洗涤后的细胞沉淀转移至YPD培养基，在30°C培养60小时后收集细胞沉淀，用于mRNA分离。基因组DNA经DNAse处理去除，cDNA用TaKaRa PCR RT Kit合成。定量PCR按前述方法进行，使用PDI、Kar2、CalB引物，Actin作为看家基因（表1）。核酸浓度用NanoDrop（Thermo Scientific，美国）测定。实时PCR在StepOne实时PCR系统（Applied Biosystems）上用Power SYBR green master mix（Invitrogen，美国）完成。未知样品的Ct值以内部看家基因beta-actin（ACT1）归一化。基因表达采用相对定量法分析。
【数据】qPCR模板DNA：4 ng；预培养OD 600 nm：2–6；培养温度：30°C；培养时间：60 h；看家基因：Arg4（拷贝数）、ACT1（表达）；仪器：NanoDrop、StepOne实时PCR系统。
2.5 脂肪酶活性测定
克隆的脂肪酶活性采用pH-stat法测定，以三丁酸甘油酯为底物。反应混合物含5 mL 10%三丁酸甘油酯、2%阿拉伯胶（乳化剂）和100–400 mM氢氧化钠（NaOH）以维持pH为7。从摇瓶或反应器收集的培养上清液在10,000 rpm离心10分钟。加入100 μl澄清培养上清液启动反应。酶活性根据维持中性pH 7.0所需NaOH随时间的添加量计算。酶活性以单位/mL（U/mL）表示。一个三丁酸甘油酯单位定义为每分钟释放1 μmol脂肪酸所需的酶量。
【数据】底物：10%三丁酸甘油酯5 mL；乳化剂：2%阿拉伯胶；NaOH浓度：100–400 mM；pH：7.0；离心：10,000 rpm、10 min；上清液用量：100 μl；酶活单位：U/mL（1单位=每分钟释放1 μmol脂肪酸）。
2.6 摇瓶与生物反应器培养
预培养在3 mL YPG培养基中进行，接种50 μl甘油储备液，于28°C孵育48小时。从预培养中取1 mL接种至250 mL锥形瓶中的50 mL YPG培养基，于28°C、200 rpm培养。收获OD 600nm为22–25的对数中期细胞，将生物量转移至10 mL YPG培养基。生物反应器研究中，FM22培养基含（每升）42.9 g KH2PO4、5 g (NH4)2SO4、1 g CaSO4·2H2O、14.3 g K2SO4、11.7 g MgSO4·7H2O和40 g甘油，用于HCDF，每升初始FM22培养基添加2 mL毕赤微量元素4（PTM4）。PTM4盐溶液含（每升）2 g CuSO4·5H2O、0.08 g NaI、3 g MnSO4·H2O、0.2 g Na2MoO4·2H2O、0.02 g H3BO3、0.5 g CaSO4·2H2O、0.5 g CoCl2、22 g FeSO4·7H2O、7 g ZnCl2、0.2 g生物素和1 mL H2SO4。培养在3.7 L搅拌罐生物反应器（Bioengineering，瑞士）中进行，工作体积2 L，无氧气富集，所有生产阶段均在28°C进行。用12.5%氨水和25%磷酸维持pH恒定在5.0，溶解氧维持在10%以上。补料分批培养中，补料含70%（v/v）甘油和每升12 mL过滤灭菌的PTM4溶液。补料速率在补料分批初期调整为10 mL/L/小时。
【数据】预培养：3 mL YPG、28°C、48 h；接种量：1 mL→50 mL YPG；摇瓶转速：200 rpm；收获OD 600nm：22–25；FM22培养基成分：42.9 g/L KH2PO4、5 g/L (NH4)2SO4、1 g/L CaSO4·2H2O、14.3 g/L K2SO4、11.7 g/L MgSO4·7H2O、40 g/L甘油；PTM4添加量：2 mL/L；反应器：3.7 L、工作体积2 L；温度：28°C；pH：5.0；溶氧：>10%；补料：70%甘油+12 mL/L PTM4；补料速率：10 mL/L/hr。
2.7 计算分析
从KEGG数据库获取S. cerevisiae和P. pastoris的PDI启动子序列，分别取PDI基因YCL043C和PAS_chr4_0844上游1000 bp。使用Pro-Coffee工具（http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/index.html）比较启动子序列的同源性。TATA box预测在https://ccg.epfl.ch//ssa/oprof.php进行。
【数据】启动子序列长度：1000 bp；数据库：KEGG；比对工具：Pro-Coffee；TATA box预测网站：https://ccg.epfl.ch//ssa/oprof.php。
研究结果
3.1 *P. pastoris* PDI1启动子序列的计算分析
对基因及其启动子转录因子调控的完整理解有助于菌株改良。酵母启动子的表征尚不充分，但S. cerevisiae启动子数据较为完善。Hac1对UPR的调控在S. cerevisiae和P. pastoris中相似。S. cerevisiae中Kar2、PDI1等靶基因的UPRE序列已有充分表征。P. pastoris中的Hac1转录因子通过靶向Kar2等UPR基因启动子区的未折叠蛋白响应元件（UPRE）来调控未折叠蛋白反应。通过人工注释，P. pastoris的PDI1启动子中仅发现一个UPRE序列，位于-625至-631处，而S. cerevisiae启动子区约有三个UPRE序列（图2）。
S. cerevisiae的大多数启动子已有转录因子结合位点数据。转录因子在进化过程中具有高度适应性，因为它们调控基因表达。Mxr1p是P. pastoris甲醇代谢基因激活所必需的转录因子，由S. cerevisiae的Adr1进化而来，获得新功能并丢失部分旧功能。P. pastoris的PDI1启动子序列中约有5个推定的Mxr1结合位点，有趣的是S. cerevisiae的PDI启动子中不存在Adr1结合位点。Ruth等人2014年描述的Aft1（铁转运激活因子）转录因子结合位点存在于P. pastoris PDI1基因启动子区，也存在于S. cerevisiae PDI启动子中。在S. cerevisiae中Aft1作为铁转运调节因子，而在P. pastoris中因缺乏铁结合基序，Aft1调控碳水化合物响应基因和分泌机制。
TATA box是真核启动子的重要特征，在转录机器组装中发挥关键作用。含TATA box序列的启动子受到高度调控，通常与应激反应相关。对两种启动子均在https://ccg.epfl.ch//ssa/oprof.php进行了TATA box序列预测。两种启动子序列均含有TATA box，其位置见图2。使用Pro-Coffee工具对S. cerevisiae和P. pastoris的PDI1启动子区进行了完整序列比对，该工具可比对同源启动子区。如图3所示，S. cerevisiae和P. pastoris的PDI1启动子之间存在相当程度的同源性。
【数据】UPRE位置：P. pastoris PDI1启动子-625至-631（1个）；S. cerevisiae启动子约3个；Mxr1结合位点：P. pastoris约5个；Aft1结合位点：两种酵母PDI启动子中均存在；TATA box：两种启动子均含有。
3.2 重组*P. pastoris*菌株的构建与基因拷贝数定量
从P. pastoris基因组DNA扩增了对应1000 bp的PDI1启动子序列。将CalB基因与本实验室研究的天然信号序列nsB框内克隆至pPDI-3′AOX、pAOX1-3′AOX和pGAP3′AOX载体中，构建了pPDI1-nsBCalB-3′AOX、pAOX1-nsBCalB-3′AOX和pGAP-nsBCalB-3′AOX三个载体（图1）。在3′AOX区的EcoNI位点进行线性化，以避免染色体基因座效应对启动子基因表达的影响。线性化构建体电穿孔转化X33宿主。随机挑选重组菌落，以基因组DNA为模板通过PCR确认基因整合。三丁酸甘油酯琼脂法对分泌脂肪酶克隆的初步筛选显示清晰的透明圈，表明CalB表达（数据未显示）。每个构建体约10个克隆经qPCR分析确定基因拷贝数。
【数据】启动子长度：1000 bp；线性化位点：EcoNI（3′AOX区）；筛选方法：三丁酸甘油酯琼脂法；qPCR分析克隆数：每个构建体约10个。
3.3 PDI1启动子与AOX1和GAP启动子在异源蛋白生产中的比较
在P. pastoris X33菌株中以nsCalB为报告蛋白，比较了pAOX1、pGAP和pPDI1启动子调控下的异源蛋白生产。摇瓶培养表达研究中分别以甲醇、葡萄糖或甘油作为碳源调控蛋白表达。为比较启动子强度，从qPCR分析中选取AOX1、GAP和PDI1启动子的单拷贝克隆进行总时长120小时的摇瓶实验。在60小时测定脂肪酶活性和nsBCalB转录本定量以比较启动子强度。然而，酶活性显示单拷贝克隆中PDI启动子下的CalB表达远低于AOX1或GAP启动子（表2）。该结果与RNA序列数据基本一致，RPKM值（每千碱基外显子每百万映射读数的读数）反映了AOX1、GAP和PDI1启动子控制下基因在不同碳源下的mRNA水平（表3）。
影响异源蛋白生产力的早期瓶颈之一是导入宿主生物体的表达盒拷贝数。多拷贝整合子的筛选已获得更高产量。基因剂量的增加可大幅提高蛋白产量。然而，蛋白生产与基因拷贝数的紧密相关性仅在产生胞内蛋白（如人超氧化物歧化酶hSOD）时成立，而使用分泌途径生产人血清白蛋白（HSA）时可见高度克隆变异性，使分泌与基因拷贝数（GCN）的直接相关性仅在低拷贝数时有效。此外，GCN只有在基因能被有效转录时才对产物产量产生积极影响。但Aw R.等人的研究报道，克隆变异性是P. pastoris的固有特征，高分泌能力克隆具有除基因拷贝数外的复杂生化特征。因此，本研究仅筛选酶活性良好的PDI1启动子克隆进行基因拷贝数和转录水平qPCR分析。
本研究发现，随着拷贝数增加，CalB活性逐渐增加至11拷贝克隆，但20拷贝克隆无显著增加（图4）。
将拷贝数为20的高拷贝数克隆在摇瓶中用三种不同碳源（葡萄糖、甘油和甲醇）比较CalB表达水平。相对而言，甲醇中的表达高于葡萄糖或甘油（图5）。
甲醇中表达显著高于甘油或葡萄糖的可能原因是PDI1启动子区存在甲醇表达调控因子（Mxr1）转录因子结合位点（图2）。然而，PDI1启动子中5个Mxr1结合位点的存在并未使其在甲醇中的强度达到AOX1启动子的水平。Mxr1结合位点数量与启动子强度之间没有相关性，因为强AOX1启动子有6个Mxr1结合位点，而弱PEX8启动子有5个Mxr1结合位点。结果表明，即使转录强度较低的PDI1启动子也可用于异源蛋白生产。
从结果可推断，4–5拷贝的PDI1启动子约等于1拷贝GAP启动子，11–20拷贝的PDI1启动子约等于AOX1启动子强度的一半。除nsBCalB在PDI1启动子下表达外，nsBCalA在PDI1启动子下表达也显示相似水平——在摇瓶水平上，葡萄糖、甘油和甲醇碳源中分别为12、15和22单位/mL。
【数据】摇瓶实验总时长：120 h；qPCR分析时间点：60 h；拷贝数与活性关系：活性增至11拷贝，20拷贝无显著增加；高拷贝（20拷贝）碳源比较：甲醇>葡萄糖≈甘油；nsBCalA表达（PDI1启动子）：葡萄糖12 U/mL、甘油15 U/mL、甲醇22 U/mL；PDI1启动子4–5拷贝≈GAP 1拷贝；PDI1启动子11–20拷贝≈AOX1强度一半。
3.4 UPR响应对高拷贝数PDI1-nsBCalB-3′AOX及CalB表达的影响
为研究高拷贝数克隆中UPR响应及其对nsBCalB转录水平的影响，对具有不同拷贝数的克隆进行了进一步分析。
【数据】原文未详述该部分具体实验数值。
讨论与解读
本研究从序列特征和功能验证两个层面系统表征了毕赤酵母PDI1启动子。序列分析揭示了P. pastoris PDI1启动子仅含一个UPRE元件（-625至-631），而S. cerevisiae含三个；同时发现P. pastoris PDI1启动子含有约5个Mxr1结合位点却无Adr1位点，这与其甲醇代谢调控的进化适应一致。功能上，PDI1启动子驱动CalB表达时，4–5拷贝相当于1拷贝GAP启动子，11–20拷贝约等于AOX1启动子强度的一半。值得注意的是，高拷贝数下PDI1启动子可被UPR诱导——这提示该启动子具有"按需增强"的特性：拷贝数增加触发UPR，反过来驱动更多分子伴侣表达以辅助蛋白折叠。
编译者解读
从合成生物学应用角度看，该研究的意义在于提供了一种"可被UPR诱导"的启动子选项。传统策略中，强启动子（如AOX1）驱动高拷贝表达常导致蛋白错误折叠负担，而本研究证明PDI1启动子可在高拷贝下被UPR激活，相当于内置了应激响应开关。4–5拷贝PDI1≈1拷贝GAP的定量关系也为表达通路的精细调谐提供了设计依据。局限在于PDI1启动子的绝对强度有限，且甲醇中表达虽优于葡萄糖/甘油，但仍弱于AOX1——这使其更适合作为辅助性启动子（如驱动分子伴侣共表达）而非主表达启动子。未来若将UPRE序列进行多位点工程改造，或可进一步提升其动态响应范围。
参考来源
Prattipati, M. (2020). Pichia pastoris Protein Disulfide Isomerase (PDI1) promoter for heterologous protein production and its sequence characterization. Enzyme and Microbial Technology. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2020.109633
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2020.109633