来源：Characterization of AnCUT3, a plastic-degrading paucimannose cutinase from Aspergillus niger expressed in Pichia pastoris（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
塑料污染已成为全球性环境危机，生物降解酶的研究为塑料回收提供了绿色新途径。本研究从腐生真菌黑曲霉（Aspergillus niger）基因组中挖掘到五个角质酶同源基因，其中AnCUT3在毕赤酵母中成功异源表达。该酶最适温度25°C、最适pH 5，对中链底物对硝基苯基癸酸酯（C10）表现出最高催化效率（kcat/Km = 859 mM⁻¹s⁻¹）。值得注意的是，AnCUT3以24 kDa和50 kDa两种糖基化形式分泌表达，其N-聚糖谱呈现非典型的少甘露糖型结构。该酶能够降解并修饰聚己内酯（PCL）和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料表面，展现了作为工业生物催化剂的潜力。
研究背景
角质素是高等植物保护性角质层的主要成分之一，由C16和C18脂肪酸构成的不溶性聚酯。角质酶（EC 3.1.1.74）是植物病原体分泌的诱导型胞外酶，通过降解角质帮助病原菌穿透植物角质层，并协同其他细胞壁降解酶最终实现宿主侵染。已有多种植原真菌的角质酶被鉴定与毒力和致病性相关，但灰葡萄孢和稻瘟病菌的研究也表明部分角质酶对真菌致病性并非必需。角质酶属于α/β水解酶家族和丝氨酸水解酶超家族，具有由亲核Ser、通用碱His和酸性Asp组成的经典催化三联体。与脂肪酶不同，经典角质酶不表现界面活化现象。角质酶的多功能性使其催化应用已远超其自然底物范围，本研究旨在通过基因组挖掘拓展角质酶类别，对黑曲霉AnCUT3进行异源表达与全面酶学表征。
图1 AnCUT3的SDS-PAGE、糖蛋白染色、酶谱分析和去糖基化分析。(A) 亲和层析纯化各组分中角质酶的SDS-PAGE图谱。MW：分子量标记；1：浓缩粗酶；2：未结合组分；3至7：含纯化角质酶的组分。(B) 纯化蛋白的SDS-PAGE酶谱分析。(C) SDS-PAGE后的糖蛋白染色。(D) PNGase F处理后的SDS-PAGE分析。
研究方法
微生物、载体、培养基及其他材料
黑曲霉ATCC 10574购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。大肠杆菌DH5α（Promega，美国）作为质粒构建和繁殖的宿主。pPICZαC载体（Invitrogen，美国）为大肠杆菌-毕赤酵母穿梭载体，先用于克隆，后在细菌和酵母中表达。甲基营养型酵母（Mut+）毕赤酵母X-33菌株（Invitrogen，美国）用于过表达胞外AnCUT3角质酶。含25 μg mL⁻¹ Zeocin的低盐Luria-Bertani培养基（LB）用于培养大肠杆菌转化子。添加不同浓度Zeocin（100 μg mL⁻¹至2000 μg mL⁻¹）的酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂用于培养毕赤酵母并筛选多拷贝整合子。BMGY、BMMY和YPD培养基均按照Easy Select™ Pichia表达试剂盒（Invitrogen，美国）说明书制备。PCR试剂、限制性内切酶、Wizard® Plus SV小量DNA纯化系统和DNA连接酶购自Promega（美国）。MEGAquick-spin™ PCR和琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒购自iNtRON Biotechnology（韩国）。核苷酸测序使用BigDye Terminator 3.1版循环测序试剂盒（Applied Biosystems，美国）。预染蛋白标记购自New England Biolabs（英国），DNA梯状标记购自Thermo Scientific（美国）和Vivantis（马来西亚）。所有用于DNA扩增和测序的引物购自Integrated DNA Technologies（新加坡）。所用化学品和生化试剂均为分析纯和分子生物学级。
【数据】Zeocin浓度：25 μg mL⁻¹（LB）/100–2000 μg mL⁻¹（YPD）；菌株：A. niger ATCC 10574、E. coli DH5α、P. pastoris X-33
黑曲霉基因组挖掘
以真菌角质酶氨基酸序列为查询序列，通过TBlastN筛选黑曲霉ATCC 1015菌株基因组。基于与PDB数据库中角质酶三维结构的相似性进一步筛选潜在蛋白。
【数据】数据库：PDB；方法：TBlastN；菌株：A. niger ATCC 1015
角质酶的计算与系统发育分析
同源性搜索在NCBI BLAST服务器上进行。使用InterPro Scan、NCBI CDART和Pfam数据库预测角质酶的保守结构域和催化活性位点。ProtParam工具用于计算蛋白质的理论等电点（pI）、分子量和氨基酸组成。信号肽切割位点位置和蛋白质细胞命运分别使用TargetP 1.1、Phobius web服务器和SignalP 4.0服务器确定。磷酸化、N-和O-糖基化位点分别使用NetPhos服务器、NetNGlyc服务器和NetOGlyc服务器预测。使用T-COFFEE生成与NCBI数据库中获得的不同真菌同源角质酶序列的多序列比对。黑曲霉与其他真菌角质酶的系统发育树在蛋白序列比对后构建。进化历史使用MEGA5中的邻接法推断。对原始序列数据进行1000次bootstrap重抽样以评估各分支的置信值。
【数据】bootstrap重抽样：1000次；软件：MEGA5（邻接法）
总DNA提取
真菌菌丝体在Potato Dextrose Broth（PDB）培养基中于摇床培养3天（180 rpm，30°C）后收获。使用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和多次沉淀步骤进行DNA提取。取2克冷冻菌丝体用研钵和研杵研磨，粉末转移至三倍体积（w/v）的提取缓冲液中（含500 mM NaCl、50 mM EDTA、50 mM Tris-HCl（pH 8.0）和1%（v/v）新鲜制备的β-巯基乙醇）。向解冻的菌丝体中加入终浓度为6%的冰冷20%（w/v）PVP储备溶液。随后加入固体十二烷基硫酸钠（SDS）至终浓度2%（w/v）。提取物在65°C孵育10分钟。接着加入1/10体积的5 M乙酸钾，冰上孵育30分钟。上清液在13,000 ×g、4°C离心10分钟后转移至新管中。随后加入5 μL RNase A（10 mg mL⁻¹），混合物在37°C孵育30分钟。按照标准DNA纯化技术操作，纯化后的DNA保存于-20°C供后续分析。
【数据】培养时间：3d；转速：180 rpm；温度：30°C；提取缓冲液：500 mM NaCl/50 mM EDTA/50 mM Tris-HCl（pH 8.0）/1% β-巯基乙醇；PVP终浓度：6%；SDS终浓度：2%；孵育：65°C 10 min；乙酸钾：1/10体积 5 M；离心：13,000 ×g 4°C 10 min；RNase A：5 μL（10 mg mL⁻¹）37°C 30 min；菌丝体用量：2 g
黑曲霉角质酶基因的分离与克隆
以黑曲霉gDNA为模板，使用Pfu DNA聚合酶（Promega，美国）通过PCR扩增Ancut3，所用特异性正向引物Ancut3-F（5′-ATG AAG TCT TTC ATC ACT CTA TCC CTC-3′）和反向引物Ancut3-R（5′-CTA AGA AGA AGA AAC CCC CGC AGC C-3′）。特异性引物根据黑曲霉ATCC 1015菌株的Ancut3序列（GenBank登录号：EHA22596.1）合成。扩增在预热的热循环仪中进行：初始变性94°C 3分钟，30个循环的94°C 30秒、64°C 30秒和72°C 1分钟，最后72°C延伸10分钟。预期大小的扩增子从琼脂糖凝胶中纯化，连接至pGEM-T Easy载体（Promega，美国），并转化大肠杆菌DH5α细胞。阳性克隆通过使用通用引物M13F、M13R、T7和SP6进行核苷酸测序确认。
【数据】引物：Ancut3-F/Ancut3-R；退火温度：64°C 30 s；循环数：30；延伸：72°C 1 min；初始变性：94°C 3 min；最终延伸：72°C 10 min
总RNA提取与cDNA合成
采用两步液体培养获得生物量。简言之，1 × 10⁶个孢子mL⁻¹的黑曲霉首先在PDB培养基中于摇床培养（2天，180至200 rpm，28°C）。随后菌丝体经无菌过滤收获，用水洗涤，转移至含0.05%角质单体16-羟基十六烷酸（16-hha）（Sigma-Aldrich，美国）的新鲜最低培养基MM中。孵育24小时后，用多层纱布收集菌丝体，用水洗涤后进行RNA提取。使用TRIzol试剂按照制造商说明书（Invitrogen，美国）提取真菌RNA。以RNA为模板，使用SuperScript® III第一链合成系统通过RT-PCR和oligo dT引物（Invitrogen，美国）进行cDNA合成。使用Pfu DNA聚合酶（Promega，美国）以2 μL总cDNA为模板扩增全长Ancut3 cDNA，所用特异性引物和反应条件与Ancut3 gDNA扩增相似。PCR扩增程序包括初始变性94°C 3分钟，随后30个循环的94°C 20秒、60°C 30秒和72°C 7分钟。扩增的cDNA随后克隆至pGEMT-Easy载体，并使用SP6和T7通用引物测序。
【数据】孢子浓度：1 × 10⁶ mL⁻¹；培养：2d，180–200 rpm，28°C；诱导物：0.05% 16-hha；孵育时间：24h；PCR循环：30次（94°C 20s/60°C 30s/72°C 7min）
Ancut3构建及线性化质粒整合入毕赤酵母
编码角质酶的cDNA序列在不含天然分泌信号序列和终止密码子的情况下，使用含ClaI和XbaI限制性位点（分别为正向和反向引物）的引物对进行扩增。以携带Ancut3 cDNA的质粒为模板。PCR产物经纯化、XbaI和ClaI双酶切后，连接至预先经ClaI和XbaI消化的pPICZαC表达载体。角质酶构建体包含编码酿酒酵母N端α-因子信号肽的序列，该序列与C端His标签同框克隆。该表达质粒构建体在大肠杆菌细胞中维持和繁殖。通过DNA测序验证该质粒构建体，命名为pPICZαC_AnCUT3。将构建体整合入毕赤酵母X-33基因组按照制造商说明进行。简言之，pPICZαC_AnCUT3经PmeI线性化后用于转化。
【数据】限制性位点：ClaI/XbaI；载体：pPICZαC；线性化酶：PmeI
图2 经肼解处理的AnCUT3来源的2-AA标记寡糖的正相HPLC分析。(A) 葡聚糖校准梯。用于测定聚糖单位（GU）值的2-AA标记葡聚糖梯标准品的HPLC分析。(B) 来自AnCUT3的2-AA荧光标记聚糖的HPLC分析。
研究结果
黑曲霉基因组中的角质酶基因
BLAST搜索揭示黑曲霉基因组中存在五个编码角质酶的基因，本文以ATCC 1015的基因ID表示（表1），所有基因均包含典型信号肽。Ancut基因的核苷酸和氨基酸序列分析表明，酶的分子量在22至27 kDa之间，等电点（pI）在4.6至5之间。AnCUT1和AnCUT2之间观察到高度相似性，两者在C端均具有延伸的丝氨酸富集序列。同样，AnCUT4和AnCUT5也具有相似特征，显示出其他三个AnCUT中不存在的内部插入序列。然而，AnCUT3似乎与其他四个AnCUT不同，它与它们的序列同一性和相似性最低。与AnCUT1和AnCUT2不同，AnCUT3在N端具有延伸的高度丝氨酸富集序列。保守结构域搜索注释了五个AnCUT序列中存在的属于丝氨酸酯酶家族的紧凑角质酶结构域。目标蛋白进一步与PDB数据库中角质酶三维结构的相似性进行比对。AnCUT1和AnCUT2与米曲霉角质酶（PDB：3GBS）相似（同一性分别为54%和72%），而AnCUT3与里氏木霉角质酶结构（PDB：4PSC_A）共享45%的同一性。AnCUT4和AnCUT5与里氏木霉乙酰木聚糖酯酶催化核心结构域（PDB：1QOZ_A）和产紫篮状菌碘化乙酰木聚糖酯酶（PDB：2AXE_A）的同一性分别为29%和32%。
【数据】分子量范围：22–27 kDa；pI范围：4.6–5；AnCUT1/AnCUT2与3GBS同一性：54%/72%；AnCUT3与4PSC_A同一性：45%；AnCUT4/AnCUT5同一性：29%/32%
黑曲霉角质酶的系统发育分析
对三条与PDB中角质酶三维结构具有序列相似性（截止值30%）的AnCUT序列（AnCUT1、AnCUT2和AnCUT3）进行系统发育分析。构建了包含23个其他物种同源角质酶的邻接（NJ）树。酵母和细菌聚为一组，丝状真菌角质酶聚为另一组。丝状真菌角质酶分为两个亚组，对应clade I和II，分别由100%和79%的bootstrap值支持。有趣的是，AnCUT1和AnCUT2聚集在一起，与其他曲霉属物种形成clade I（bootstrap 66%）。而AnCUT3则归入另一个由来自禾本科布氏白粉菌、芸苔球腔菌等病原真菌以及绿木霉和哈茨木霉等真菌寄生菌的角质酶序列组成的clade。
【数据】bootstrap值：clade I 100%、clade II 79%、曲霉属clade 66%；序列相似性截止值：30%
AnCUT3在毕赤酵母中的克隆与表达
编码AnCUT3的1047 bp全长DNA序列包含两个分别为102 bp和72 bp的内含子，相应cDNA的873个核苷酸编码290个氨基酸的蛋白质（GenBank登录号KM205643）。蛋白质计算分子量为29 kDa，预测pI为5.1。信号肽预测服务器显示切割位点在氨基酸15和16之间，表明其可能是胞外蛋白。当使用2%（v/v）甲醇诱导转化子时，AnCUT3在毕赤酵母X-33中的最高表达水平约为24 U mL⁻¹。从HisTrap HP柱洗脱的蛋白质经纯度检查（相同组分合并）后进行MS/MS鉴定。SDS-PAGE中观察到约24和50 kDa的两个明显条带（图1A）。进一步分析以确定这两种蛋白质中哪一种负责水解酶活性。从纯化蛋白的SDS-PAGE酶谱图（图1B）中观察到两个棕色条带，对应约24和50 kDa的分子量，表明两个条带均具有酯酶活性。由于两个值均与从翻译的Ancut3序列数据计算的质量不符，推测必然发生了翻译后修饰。例如，较大的50 kDa条带可能经历了糖基化。SDS-PAGE后的糖蛋白染色将24和50 kDa两个蛋白条带着色为品红色，表明它们均被糖基化（图1C）。使用NetNGlyc、NetOGlyc和NetPhos服务器重新分析蛋白质序列表明，AnCUT3中可能存在1个N-糖基化、29个O-糖基化和31个磷酸化位点。用肽N-4（N-乙酰-β-葡糖胺基）天冬酰胺酰胺酶F（PNGase F）（图1D）和O-糖苷酶处理AnCUT3均未影响24和50 kDa条带。这表明PNGase F和O-糖苷酶均未切割相关的糖-蛋白键（PNGase F的GlcNAc与N之间以及O-糖苷酶的GalNAc与S/T之间）。另一方面，使用肼解法对AnCUT3进行化学处理释放出N-聚糖峰，随后经2-AA标记并使用GU分析方法鉴定。2-AA标记聚糖的GU值根据材料与方法部分所述使用葡聚糖梯标准品生成的方程y = 2E-07x⁵ − 3E-05x⁴ + 0.002x³ − 0.060x² + 0.944x − 2.701计算。将计算出的GU值与Alonzi等人先前报道的2-AA标记聚糖进行比较，显示存在多个少甘露糖型N-聚糖峰（≤Man1-5GlcNAc：截短的寡甘露糖）：Man1GlcNAc1（GU 2.06）、Man2GlcNAc1（GU 2.97）、Man3GlcNAc1（GU 3.98）和Man5GlcNAc1（GU 5.11）（图2B）。与纯化的AnCUT3糖蛋白相反，粗上清液总聚糖库的HPLC-FD聚糖谱显示GU 15-20的高甘露糖型结构。此外，通过MALDI-TOF/TOF质谱鉴定约24和50 kDa的蛋白质，发现肽序列KLTFIFAR的存在。该肽序列在约24和50 kDa的蛋白质中均被发现，并与AnCUT3氨基酸序列匹配。这些结果证实AnCUT3以糖基化的约24和50 kDa重组蛋白形式表达。
【数据】基因全长：1047 bp；内含子：102 bp + 72 bp；cDNA：873 bp；氨基酸数：290；分子量（计算）：29 kDa；pI：5.1；表达水平：~24 U mL⁻¹（2%甲醇诱导）；SDS-PAGE条带：~24和~50 kDa；预测修饰位点：1个N-糖基化、29个O-糖基化、31个磷酸化；GU值：2.06/2.97/3.98/5.11
图3 温度和pH对黑曲霉AnCUT3的影响。(A) 确定酶最适温度的温度范围酶活性谱。(B) 确定温度稳定性的pH范围酶活性谱。(C) 确定最适pH的pH范围酶活性谱。(D) 确定pH稳定性的酶活性谱。
理化特征与动力学参数
AnCUT3在一系列温度范围内均有活性，在25°C时达到峰值（图3A），并在高达50°C的温度下稳定，1小时内保留>70%活性（图3B）。最适活性pH为5，在pH 3时酶活性<40%（图3C）。在pH 9和10孵育60分钟后，酶保留>60%活性（图3D）。大多数金属离子在1 mM浓度下对酶活性无影响（图4）。AnCUT3活性被表面活性剂SDS完全抑制，并受丝氨酸水解酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）（80%抑制）、Cu²⁺、Mn²⁺和Ni²⁺（10 mM时50%抑制）的强烈影响。然而，二硫苏糖醇（DTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、Mg²⁺、Na⁺和尿素对AnCUT3活性无抑制作用，但Na⁺在10 mM时显示酶活性略有增加（≤20%）。重组AnCUT3角质酶对短链底物（pNPV、pNPB）表现出比其它底物更高的V_max和k_cat值（表2）。然而，酶对中链（pNPD）和短链（pNPV）底物分别表现出最高和最低的亲和力。k_cat/K_m值证实pNPD可被AnCUT3有效消化。在圆二色光谱（CD）中，肽键在193至250 nm波长范围内吸收。AnCUT3在208和222 nm处出现双负最小值，在193 nm处出现正最大值（图5A）。光谱形状与典型的α/β蛋白一致，特别是与角质酶一致。这也与先前研究一致，表明五种不同真菌角质酶的CD扫描几乎相同。随着温度升高（25、30、40和45°C），记录到几乎相同的光谱，尽管椭圆率（α-螺旋减少）随高温扫描而增加（图5B）。综合来看，这些数据表明酶在测试温度范围内仍以折叠状态存在。
图4 试剂和金属离子对AnCUT3活性的影响。角质酶与各种离子在25°C预孵育60分钟，然后测定活性。残余活性以无添加（None）样品的比活性为对照计算，设为100%。
图5 纯化AnCUT3的CD光谱谱图。(A) AnCUT3在25°C和pH 5.0下的远紫外光谱。(B) AnCUT3在不同温度下的远紫外光谱。
【数据】最适温度：25°C；温度稳定性：≤50°C保留>70%（1h）；最适pH：5；pH 3残余活性：<40%；pH 9/10保留活性：>60%（60 min）；金属离子抑制（10 mM）：PMSF 80%、Cu²⁺/Mn²⁺/Ni²⁺ 50%；Na⁺激活：≤20%；CD特征峰：208/222 nm负、193 nm正
图6 AnCUT3的热诱导去折叠。(A) 在222 nm处收集的AnCUT3角质酶的CD光谱。(B) AnCUT3角质酶的DSC热谱图。
图7 AnCUT3处理前后PCL和PET颗粒表面的SEM显微照片（1000×放大）。(A) 磷酸盐缓冲液（pH 5）中的PCL（阴性对照）。(B) AnCUT3处理的PCL。(C) 磷酸盐缓冲液（pH 5）中的PET（阴性对照）。(D) AnCUT3角质酶处理的PET。
图8 PCL处理样品的DI-ESI-MS（正离子模式）分析显示存在消化产物6-羟基己酸和ε-己内酯二聚体。
图9 AnCUT3的结构模型与米曲霉角质酶的晶体结构。(A) AnCUT3（灰色）与米曲霉角质酶（青色）（PDB：3GBS）的叠加模型示意图。二硫键以球体表示；箭头指示两个结构域中二硫键的存在。
讨论与解读
本研究通过计算机分析确认黑曲霉ATCC 1015基因组中存在五个角质酶编码基因，与Nyyssölä等人的报道一致。序列分析和系统发育树显示，细菌和隐球菌角质酶序列与真菌序列共享约21–30%的相似性，表明这些生物经历了广泛的进化变异。AnCUT3氨基酸序列的BlastP分析显示与曲霉属角质酶高度相似，与黑曲霉CBS 513.88角质酶（XP_001399211.1）、黑曲霉ATCC 1015假定蛋白（EHA22596.1）和棘孢曲霉假定蛋白（GAA92816.1）的相似性分别为99%、97%和96%。AnCUT3在毕赤酵母中表达产生两种活性蛋白（约24和50 kDa），酶活性为54 U mL⁻¹。AnCUT3能够降解并修饰PCL和PET塑料表面，这一特性使其成为具有工业应用潜力的生物催化剂。
【数据】序列相似性：99%（XP_001399211.1）、97%（EHA22596.1）、96%（GAA92816.1）；酶活性：54 U mL⁻¹
编译者解读：AnCUT3的研究价值在于其独特的糖基化模式——毕赤酵母中表达的真菌角质酶竟携带少甘露糖型N-聚糖而非典型的高甘露糖型结构，这提示不同蛋白在相同宿主中的糖基化加工存在底物依赖性差异。从塑料降解应用角度看，AnCUT3在温和条件（25°C、pH 5）下即可作用于PCL和PET表面，虽然其热稳定性有限（Tm 45.6°C），但中链底物的高催化效率（859 mM⁻¹s⁻¹）为后续通过定向进化提升其塑料降解活性提供了良好的出发酶。该研究拓展了角质酶资源库，也为理解真菌角质酶的糖基化多样性提供了新案例。
参考来源
Altammar K.A. Characterization of AnCUT3, a plastic-degrading paucimannose cutinase from Aspergillus niger expressed in Pichia pastoris. International Journal of Biological Macromolecules, 2022. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2022.10.022
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2022.10.022